В A. nidulans FITC-конъюгированный лектин WGA можно использовать для обнаружения участков отложения клеточной стенки (Harris et al. 1999). При концентрации 5 мкг / мл окрашивание FITC-WGA ограничивается только кончиками гиф дикого типа ().У мутантов Δ atmA кончики гиф также окрашивались FITC-WGA, но также наблюдалось заметное окрашивание тел спор (). Это наблюдение предполагает, что пул везикул, несущих предшественники для биосинтеза клеточной стенки, неправильно удерживался в теле спор. Гифы дикого типа, выращенные в присутствии беномила, деполимеризующего микротрубочки, обнаруживают аналогичную интенсивную локализацию FITC-WGA в теле спор (), хотя в этом случае окрашивание кончика гифа не наблюдается.Соответственно, мы предполагаем, что дефект микротрубочки-зависимого транспорта везикул лежит в основе аберрантного паттерна отложения клеточной стенки у мутантов Δ atmA .

Рост не ограничивается кончиком гифа у мутантов Δ atmA . Гифы окрашивали агглютинином зародышей пшеницы, конъюгированным с FITC, для локализации участков активного отложения на клеточной стенке. Рост происходит на концах гиф дикого типа (A, стрелка). У мутантов Δ atmA (B) также наблюдается рост тела спор (стрелка).В гифах дикого типа, которые проросли в присутствии 5 мкг / мл беномила, рост в основном ограничивается телом спор (C). Прутки, 10 мкм.

Иммунофлуоресцентная микроскопия с антителами против β-тубулина была использована для исследования состояния цитоплазматических микротрубочек у мутанта Δ atmA . При просмотре с помощью конфокальной микроскопии с лазерным сканированием, гифы дикого типа имели продольные массивы цитоплазматических микротрубочек, которые заканчивались на дискретном участке внутри кончика гифы (). Напротив, у мутанта Δ atmA массивы микротрубочек обычно не оканчивались на дискретном сайте, а вместо этого, по-видимому, расширялись случайным образом ().Количественная оценка этих фенотипов показала, что 51% гиф Δ atmA обладают цитоплазматическими микротрубочками, которые не могут сходиться в отдельном месте, по сравнению только с 9,5% гифов дикого типа ( n = 100; два независимых эксперимента;). Эти наблюдения подтверждают, что морфогенетические дефекты, наблюдаемые у Δ atmA мутантов, отражают неспособность специфицировать сайт захвата кортикальных микротрубочек на концах гиф.

Микротрубочки не могут сходиться на кончике гифы у мутантов Δ atmA .Гифы дикого типа (A – D) и Δ атм. (E – H) исследовали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. (A и E) Ядра, визуализированные с использованием Hoechst 33258. (B и F) Микротрубочки, визуализированные с помощью антител против β-тубулина. (C и G) объединенное изображение. (D и H) Изображения светлого поля (один раздел, тогда как все остальные изображения представляют собой максимальную проекцию Z-стеков). (I) Организация микротрубочек на кончике гифы увеличена, чтобы выделить дефект. Прутки, 5 мкм.

ОБСУЖДЕНИЕ

ATM и ATR являются паралогическими PIKK, которые организуют ответ на повреждение ДНК в эукариотических клетках (Shiloh 2001; McKinnon 2004).Эти киназы играют как перекрывающиеся, так и разные роли в регуляции этого ответа. В A. nidulans мы ранее показали, что UvsB ^ATR регулирует реакцию контрольной точки повреждения ДНК, ингибирует септацию в предделенных гифах, которые испытали повреждение ДНК, и контролирует как экспрессию, так и локализацию белков, участвующих в процессинге и репарации. повреждений ДНК (Харрис и Краус 1998; Хофманн и Харрис 2000; Фагундес и др. 2005).В этом исследовании мы представляем первый анализ ATM в мицелиальных грибах. Как и другие киназы ATM, мы показываем, что AtmA ^ATM модулирует ответы контрольных точек повреждения ДНК и фосфорилирует нижележащую мишень ScaA ^NBS1 . Однако мы также демонстрируем, что AtmA ^ATM играет дополнительную роль в формировании стабильных осей поляризованного роста гиф. В этом отношении AtmA может разделять основную функцию со своими гомологами в других высокополяризованных типах клеток, таких как нейроны.

Роль AtmA

Наши результаты демонстрируют, что AtmA ^ATM предотвращает митотический вход, когда ДНК повреждена во время S или G ₂ фаз клеточного цикла. В некоторой степени это может объяснить чувствительность к повреждению ДНК мутанта Δ atmA , потому что спящие конидиоспоры, в которых контрольная точка не обязательна, демонстрируют уровни устойчивости дикого типа к некоторым формам повреждения ДНК. С другой стороны, AtmA ^ATM , вероятно, играет дополнительную роль в стимулировании репарации ДНК.Как и у других эукариот, одна из таких функций может заключаться в регулировании активности комплекса MRN (D’Amours and Jackson 2002). Гомологи каждого компонента этого комплекса были охарактеризованы в A. nidulans (, т.е. , MreA = Mre11, SldI = Rad50 и ScaA = Nbs1), и было показано, что они участвуют во многих аспектах реакции на повреждение ДНК (Bruschi и др. 2000; Семигини и др. 2003; Малавази и др. 2005). Примечательно, что UvsB ^ATR регулирует как экспрессию, так и ядерную локализацию ScaA ^NBS1 (Fagundes et al. 2005), тогда как AtmA ^ATM контролирует уровень фосфорилирования ScaA ^NBS1 . Эти различные регуляторные входы могут потенциально придавать ATR- и ATM-специфические функции комплексу MRN A. nidulans . В качестве альтернативы они могут действовать согласованно, чтобы гарантировать полную активацию комплекса в ответ на присутствие поврежденной ДНК. Для рассмотрения этих возможностей необходим более подробный анализ взаимодействий между комплексом MRN и UvsB ^ATR и AtmA ^ATM .

UvsB ^ATR ингибирует образование перегородки в предделительных гифах, подвергшихся воздействию низких уровней повреждения ДНК (Harris and Kraus 1998). Хотя этот эффект опосредован Ank ^WEE1 -зависимым Tyr-15 ингибирующим фосфорилированием NimX ^CDK1 (Kraus and Harris 2001), механизм, с помощью которого UvsB ^ATR может влиять на состояние фосфорилирования Tyr-15 NimX ^CDK1 не определено. Напротив, AtmA ^ATM , по-видимому, не участвует в ингибировании образования перегородки.Вместо этого мутация Δ atmA усугубляет блокаду перегородки. Это могло просто отражать увеличение силы сигнала повреждения ДНК, вызванное потерей AtmA ^ATM . Однако интригующая возможность состоит в том, что AtmA ^ATM может непосредственно способствовать образованию перегородки во время восстановления после ответа на повреждение ДНК. Ранее мы показали, что для этой функции необходим гомолог геликазы A. nidulans RecQ / BLM MusN ^BLM (Hofmann and Harris 2001).Поскольку обширные взаимодействия между ATM и BLM были охарактеризованы в клетках животных (Beamish et al. 2002), есть соблазн предположить, что подобные взаимодействия могут запускать восстановление после ответа ДНК в предделенных гифах.

Роль AtmA

Наблюдение, что AtmA ^ATM требуется для формирования стабильной оси полярности гиф, было неожиданным. В дрожжевых клетках функция ATM никогда не была связана с установлением или поддержанием клеточной полярности.Более того, только в клетках Пуркинье человека и мыши ATM участвует в функциях, связанных с клеточным морфогенезом (Barlow et al. 2000). Соответственно, наши результаты поднимают интересную возможность того, что ATM обладает уникальной и ранее не охарактеризованной ролью в формировании стабильных осей полярности, которые специфичны для сильно поляризованных клеток, таких как гифы и нейроны. Кроме того, мы предполагаем, что невыполнение этой функции вызывает морфологические дефекты, которые нарушают дифференцировку нейронов и, таким образом, вносят вклад в патологию A-T.

Наши наблюдения показывают, что AtmA требуется для определения зоны роста на концах гиф. У нитчатых грибов апикальный кластер пузырьков и цитоскелетных элементов, названный Spitzenkorper, играет критическую роль в определении зоны роста (обобщено Harris et al. 2005). Примечательно, что взаимодействия между цитоплазматическими микротрубочками и клеточной корой, по-видимому, играют важную роль в поддержании положения Spitzenkorper в середине зоны роста (Konzack et al. 2005). Мы предполагаем, что AtmA-зависимое фосфорилирование может влиять на эти взаимодействия, тем самым помогая определить дискретную зону кортикального рекрутирования цитоплазматических микротрубочек. Отсутствие этой зоны у мутанта Δ atmA , по-видимому, должно приводить к случайным взаимодействиям между микротрубочками и корой на концах гиф, что, в свою очередь, должно влиять на положение Spitzenkorper и поддержание стабильной оси полярности. В соответствии с этой гипотезой, Horio and Oakley (2005) продемонстрировали, что хотя микротрубочки не являются строго необходимыми для поляризованного роста, они ограничивают скорость роста клеток кончиков гиф.Какие белки на кончике гифы могут быть мишенями ATM-зависимой регуляции? Потенциальные кандидаты включают белки, которые связываются с положительными концами цитоплазматических микротрубочек, такие как динактин, который был предложен в качестве возможной мишени ATM (O’Neill et al. 2000), или кинезины с положительным концом, участвующие в транспорте. этих белков. Один такой кинезин, KipA, как уже было показано, регулирует положение Spitzenkorper (Konzack et al. 2005). Альтернативно, гомологи известных белков кортикальных микротрубочек из почкующихся или делящихся дрожжей ( i.e ., Kar9, Tea1, Tea4) могут быть целями банкоматов. Наконец, грибковые β-адаптины, чьи животные гомологи являются известными субстратами ATM, могут быть мишенями AtmA, которые контролируют перемещение ориентирующего белка, который определяет кортикальную зону для взаимодействий микротрубочек. Протеомные подходы, разработанные для идентификации взаимодействующих с AtmA партнеров, должны в конечном итоге выявить соответствующую мишень.

Сравнительная геномика раскрывает происхождение грибных гиф и многоклеточность

Введение

Эволюция многоклеточности (МС) считается одним из важнейших переходов в истории жизни ¹ .Он развился в несколько про- и эукариотических линий ^2–7 , каждая из которых представляет собой уникальное решение проблем многоклеточной организации ⁶ . У эукариот два основных способа приобретения многоклеточности — это клональный и агрегативный пути ^5,6,8–10 , которые различаются тем, как многоклеточные предшественники возникают в результате адгезии, кооперации, коммуникации и функциональной диверсификации клеток ^{3,11 , 12} .

Грибы представляют одно из трех царств, в которых многоклеточные формы доминируют среди существующих видов ¹³ , однако наши знания об эволюционном происхождении многоклеточности в этой группе очень неполны.В то время как большинство многоклеточных клонов можно распознать либо как клональные, либо как агрегированные по сравнению с их одноклеточными родственниками, многоклеточность грибов не выдерживает такой классификации ^6,14 . Талломы грибов состоят из гиф, тонких трубчатых структур, которые растут за счет апикального расширения и образуют мицелий, который исследует субстрат и проникает в него. Многоклеточность гифа обладает рядом уникальных свойств по сравнению с клональной и агрегативной многоклеточностью, что повышает вероятность того, что ее эволюция следует совершенно другим принципам ⁷ .Во-первых, гифы могли развиться в результате постепенного удлинения ризоидов, заякоренных в субстрате ранних грибов ^15–18 , через многоядерные промежуточные соединения, в отличие от клональных и агрегатных клонов, где первые многоклеточные кластеры, вероятно, возникли через связанные клетки, слипшиеся вместе. (например, хоанофлагелляты ¹⁹ ) или собираются в синцитиальное тело (например, Capsaspora ) ⁹ . Поскольку ранние гифы не были разделены на части, их эволюция могла бы избежать необходимости разрешать групповые конфликты и выравнивать приспособленность индивидуальных клеток ⁷ .Как вариант, возможно, что конфликты разрешаются на уровне отдельных ядер ²⁰ . Во-вторых, гифы максимизируют эффективность кормодобывания и усвоения питательных веществ и сводят к минимуму конкуренцию за питательные вещества за счет фрактального режима роста ^16,21,22 . Этот способ происхождения отличается от других многоклеточных линий, где отбор на увеличенный размер, возможно, помог избежать хищничества ² . Гифы также могли облегчить переход грибов к наземной жизни ²³ и придать огромное медицинское значение патогенным грибам ²⁴ .Гифы современных грибов редко слипаются друг с другом в вегетативном мицелии, и адгезия становится ключевой только в плодовых телах ^25–27 — которые по уровню сложности напоминают сложные многоклеточные многоклеточные и растения ^7,28 — или в прикреплении. для размещения поверхностей ²⁹ . Т.о., тогда как в большинстве многоклеточных клонов адгезия, межклеточная кооперация, коммуникация и дифференцировка представляют основные препятствия на пути появления многоклеточных предшественников ^3,6,30–32 , грибы могли иметь разные препятствия, которые нужно было преодолеть.

В то время как происхождение гиф малоизвестно, информация о молекулярной и клеточной основе морфогенеза гиф обширна (недавние обзоры см. Ссылки ^33–38 ), что позволяет провести эволюционный геномный анализ происхождения гиф. Морфогенез гифов основан на сетях поляризации клеток ³⁹ , экзо- и эндоцитотическом аппарате ⁴⁰ , транспорте везикул на большие расстояния, а также на специфичных для грибов признаках, таких как синтез и сборка клеточной стенки ⁴¹ , а также на выборе точек ветвления и сайтов септации ⁴² и др.Ключевой структурой роста гиф является Spitzenkörper ⁴³ , который действует как распределительный центр для пузырьков, транспортирующих материалы клеточной стенки и различные факторы к кончику гифы. Цитоплазматическая сеть микротрубочек обеспечивает связь между грузом везикул через ER, Гольджи и Spitzenkörper, откуда везикулы перемещаются по актиновым микрофиламентам к кончику гифы и секретируют свое содержимое, откладывая новые компоненты клеточной стенки и обеспечивая расширение поверхности. Дальнейшие ключевые процессы включают рециклинг избыточной мембраны в субапикальной зоне, активацию путей цАМФ и каскадов митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и, наконец, транскрипционный контроль морфогенеза (подробные обзоры см. Ссылки ^44–49 ).

О сложном слоевище гиф было сообщено из окаменелости Blastocladiomycota возрастом 407 миллионов лет ⁵¹ , тогда как гифы и споры, похожие на Glomeromycotina, сохранились 460 миллионов лет назад ^50,52 , что указывает на то, что рост гифов относится, по крайней мере, к ордовику. . Большинство Dikarya и Mucoromycota выращивают настоящие гифы, тогда как значительное разнообразие форм обнаруживается у ранних расходящихся Blastocladiomycota, Chytridiomycota и, в меньшей степени, у Zoopagomycota. В Chytridiomycota преобладают одноклеточные формы, которые прикрепляются к субстрату с помощью разветвленных корневидных ризоидов ^16,50 , которые предположительно являются предшественниками гиф ^15,53 .Альтернативная гипотеза определяет гифоподобные соединения в талломах полицентрических хитридовых грибов (например, Physocladia ) как промежуточные звенья к истинным гифам ¹⁷ . Как и хитриды, большинство Blastocladiomycota образуют моно- или полицентрические одноклеточные слоевища, хотя некоторые виды образуют широкие, апикально растущие структуры, напоминающие настоящие гифы (например, Allomyces ) или узкие выходные трубки на зооспорангиях (например, Catenaria spp.) ^{16,50 , 54} . Несмотря на эти промежуточные формы, одноклеточное доминирование в этих типах хорошо согласуется с одноклеточным происхождением и потенциальным конвергентным происхождением гифоподобных структур ¹⁷ .

Здесь мы исследуем эволюцию многоклеточности гиф у грибов путем реконструкции исторических паттернов известных генов морфогенеза гиф, а также путем систематического поиска геномов грибов для семейств генов, эволюция которых коррелирует с эволюцией гиф. Мы анализируем геномы 4 плезиоморфно одноклеточных, 40 гиф (один из которых неоднозначен) и 14 вторично упрощенных (дрожжевых) грибов, а также 13 негрибковых родственников. Учитывая вероятное конвергентное происхождение гиф, мы фокусируем наш анализ на нескольких узлах грибного дерева, где можно с уверенностью локализовать источник (и) роста гиф.Наш анализ показывает глубокое эукариотическое происхождение большинства семей, связанных с морфогенезом, ограниченную диверсификацию семейств генов в корреляции с появлением MC гиф и что вторично упрощенные дрожжеподобные грибы сохранили большую часть генов многоклеточного роста.

Результаты и обсуждение

Гифы произошли от ранних предков грибов

Чтобы понять происхождение гиф, мы построили филогению видов, представляющую 71 вид (дополнительная таблица 1), путем анализа максимального правдоподобия суперматрицы из 595 однокопийных ортологов (175,535 иероглифы Рис.1а).

Эволюция многоклеточности гиф и лежащих в основе генов у грибов. (а) Филогенетические отношения среди 71 вида, проанализированного в этом исследовании. Круговые диаграммы в узлах показывают пропорциональную вероятность гифальных (зеленый) и не-гифальных (темно-синий) состояний предков, реконструированных с использованием байесовского MCMC. Кодирование состояния символов существующих видов, используемое при реконструкции состояния предков, показано рядом с названиями видов. Узлы BCZ: происхождение роста гиф может быть определено с уверенностью, выделены (обратите внимание на неопределенность, обусловленную нитчатыми Blastocladiomycota).(б) распределение собранных в литературе генов морфогенеза гиф по 10 основным функциональным категориям. (c) Предковые реконструкции числа копий гена в 9 основных категориях генов, связанных с морфогенезом гиф (см. рис. 5c для адгезии). Размер пузыря пропорционален реконструированному числу копий предкового гена. Узлы BCZ показаны желтым.

Филогения нашего вида воспроизводит недавние геномные филогении грибов ^55–58 , при этом Rozellomycota, Blastocladiomycota и Chytridiomycota отделяют первую, вторую и третью часть мевочной кости соответственно (бутстрап ML: 100%).Мы выполнили реконструкцию состояния предков с использованием байесовского MCMC, чтобы определить предполагаемое происхождение роста гиф. Это поддерживало появление гиф от одноклеточных предков у базальных грибов. Распределение значений апостериорной вероятности указывает на три узла как наиболее вероятные источники многоклеточности гиф, которые представляют собой разделение линий Blastocladiomycota, Chytridiomycota и Zoopagomycota, называемых далее узлами BCZ. Апостериорная вероятность состояния гиф начала расти у самого недавнего общего предка (MRCA) Blastocladiomycota и высших грибов (PP: 0.53, рис. 1а) и увеличился до 0,68 и 0,92 в следующих двух узлах на основе дерева. Это предполагает, что гифы эволюционировали либо в одном из узлов BCZ, либо это мог быть постепенный процесс, разворачивающийся в этих трех узлах. Эта неопределенность, вероятно, отражает различные гифоподобные морфологии у Blastocladio- и Chytridiomycota и согласуется с конвергентным происхождением гифоподобных морфологий ^7,17,18 . Чтобы учесть эту неопределенность, мы сосредотачиваемся на узлах BCZ в последующем анализе генов морфогенеза гиф.

Эволюция генов морфогенеза гиф

Наш обзор литературы по генам, связанным с многоклеточностью гиф, дал 651 ген (из 519 публикаций), в основном из хорошо изученных модельных систем, таких как A. fumigatus, A. nidulans, N. crassa, S. cerevisiae и C. albicans (дополнительная таблица 2). Мы классифицировали гены в соответствии с более широкой функцией, которую они выполняют в росте гиф, на девять функциональных групп: регуляция актинового цитоскелета, поддержание полярности, биогенез / ремоделирование клеточной стенки, перегородка (включая закупорку перегородки), передача сигналов, регуляция транскрипции, транспорт везикул, транспорт на основе микротрубочек. и регуляция клеточного цикла.Категории «поддержание полярности» и «транспорт везикул» содержали наибольшее количество генов (107 в каждой), тогда как «регуляция клеточного цикла» — наименьшее (11) (рис. 1б). Собранные гены сгруппированы в 362 семейства с помощью марковской кластеризации набора данных из 71 генома.

Реконструкции историй дупликации / утраты генов для девяти функциональных категорий семейств генов морфогенеза гиф показаны на рис. 1c. Общая закономерность, которая вытекает из этого, заключается в том, что происхождение многих семейств генов (181 семейство, 50%) предшествует происхождению MC гиф (рис.2, дополнительный рис. 1), что указывает на то, что грибы кооптировали несколько консервативных эукариотических функций для роста гиф. Значительная доля семейств генов, связанных с многоклеточностью (164 семейства, 45,3%), возникла после происхождения MC гиф, что указывает на генетические инновации, специфичные для клонов и видов. Только 17 семейств (4,7%) произошли в узлах BCZ и впоследствии были сохранены (Table 1), обеспечивая потенциальных кандидатов, которые сформировали эволюцию MC гиф. К ним относятся два семейства регуляторов транскрипции (кодирующие белки StuA и MedA в A.fumigatus ) ^59,60 , шесть из них связаны с биогенезом клеточной стенки, три — с регуляцией актинового цитоскелета, три — с поддержанием полярности, два семейства участвуют в передаче сигналов, а одно — в регуляции клеточного цикла. Одно из семейств содержит S. cerevisiae Pan1, эндоцитарный адаптерный белок на плазматической мембране. Pan1 запускает рекрутирование комплекса Arp2 / 3 в сайт эндоцитоза, который необходим для рециклирования избыточной мембраны в субапикальной области во время роста гиф ⁴⁰ .Другой пример — полярисомный компонент BNI-1 из N. crassa . Нокаут-исследования показали, что он обеспечивает сборку актинового кабеля у нитчатых грибов и играет роль в разнообразных процессах, связанных с морфогенезом ⁶¹ . Другими белками, участвующими в установлении клеточной полярности, являются фактор реорганизации актинового цитоскелета Bem1 ^62,63 и Rax1, связанный с биполярным почкованием в S. cerevisiae ⁶⁴ .

Филогенетическое возрастное распределение генов морфогенеза гиф.Рисунок отражает основной текст рисунка 2 с названиями генов для каждой точки.

Филогенетическое возрастное распределение генов морфогенеза гиф. Схематический контур терминальной клетки гифы показан с генами, отмеченными точками и окрашенными в соответствии с филогенетическим возрастом. Гены, происхождение которых предшествует многоклеточности гиф (зеленый, 72,2%), доминируют в морфогенетическом аппарате гиф, за ними следуют гены, которые произошли от MC гиф (желтый, 21,2%), и гены, происхождение которых примерно совпадает с происхождением гиф (фиолетовый , 6,6%).Данные основаны только на ортологах A.fumigatus . См. Также дополнительный рисунок 1 для названий генов.

Список 17 семейств генов, появление которых показывает корреляцию с эволюцией MC гиф на основе анализа COMPARE.

Семейства генов, связанные с септацией, поддержанием полярности, контролем клеточного цикла, транспортом везикул и транспортом на основе микротрубочек, как правило, более разнообразны у животных, негрибных эукариот и их предков, чем у грибов, что предполагает hyphal MC, они эволюционировали в основном за счет потери генов у грибов (Fig 1c).Синтез и ремоделирование клеточных стенок, а также семейства, связанные с регуляцией транскрипции, с другой стороны, обнаруживают экспансию в грибах MC, предполагая, что диверсификация этих семейств генов могла играть роль в эволюции MC гиф (Fig 1c).

Девяносто три (25,7%) из 362 семейств генов, связанных с морфогенезом гиф, показали дупликации в узлах BCZ (дополнительная таблица 3). Обогащающий анализ дупликаций генов не выявил отдельных семейств генов со значительно увеличенным числом дупликаций (исправленный Бенджамини-Хохбергом P <0.05, точный тест Фишера) в узлах BCZ относительно остальной части дерева (дополнительная таблица 4). Тот же анализ 9 функциональных групп показал значительно увеличенное количество дупликаций в категориях биогенеза клеточной стенки и регуляции транскрипции. Эти анализы предполагают, что эволюция роста гиф в узлах BCZ в целом не совпадала с периодом обширной дупликации генов, за исключением биогенеза клеточной стенки и семейств генов, связанных с регуляцией транскрипции. В совокупности реконструкции эволюции семейства генов выявили отсутствие крупного всплеска происхождения семейства генов или дупликаций, совпадающих с эволюцией MC гиф.

Мы проанализировали, коррелируют ли изменения основных структурных свойств генов с эволюцией ТЦ гиф. Значительные различия (P <0,05) наблюдались в длинах генов, CDS и интронов между одноклеточными и многоклеточными грибами (дополнительный рисунок 2, дополнительная таблица 5). Длины CDS генов разделения и сохранения полярности были значительно выше у многоклеточных, чем у одноклеточных грибов (P = 0,0012-0,00017, дополнительный рис. 2). Противоположная картина наблюдалась в длинах интронов, которые в среднем были больше у одноклеточных грибов в актиновом цитоскелете, биогенезе клеточной стенки, поддержании полярности, генах, связанных с септацией и транспортом везикул.В генах, связанных с актиновым цитоскелетом, длина CDS и длина интрона демонстрировали одинаковый характер: оба они были длиннее у многоклеточных видов. Длина генов и CDS была значительно больше у одноклеточных, чем у многоклеточных грибов, в генах, кодирующих адгезионные и транспортные белки на основе микротрубочек. С другой стороны, что интересно, никаких значительных изменений в структуре генов не было обнаружено в биогенезе клеточной стенки и генах, связанных с регуляцией транскрипции, двух категориях, которые продемонстрировали значительную диверсификацию семейств генов у ранних мицелиальных грибов.

Статистические сравнения основных структурных свойств генов, относящихся к MC гиф. Коробчатые диаграммы отображают различия в длине генов, CDS и интронов у 4 одноклеточных (желтый) и 39 многоклеточных грибов (синий) в девяти функциональных категориях.

Фагоцитоз утрачен, но гены фагоцитоза сохраняются грибами

Наши наборы генов морфогенеза гиф включали несколько записей, связанных с фагоцитозом у негрибковых эукариот. Это удивительно, учитывая, что фагоцитоз у грибов не известен, и их жесткая клеточная стенка образует для него физический барьер.Поэтому мы исследовали судьбу генов фагоцитоза у нитчатых грибов на основе фагоцитозного аппарата D. discoideum ^65,66 и других эукариот ⁶⁷ . Нитчатые грибы сохранили несколько семейств фагоцитозных генов, но потеряли другие (рис. 3). Напр., Члены комплекса Arp2 / 3, который нуклеирует актиновые филаменты и запускает перестройки актинового цитоскелета ⁶⁸ , консервативен в мицелиальных грибах и участвует в росте гиф ⁶⁹ .Гены поглощения и подвижности клеток (ELMO1 / 2) обнаружены у всех нитчатых грибов, но конвергентно теряются у почкующихся и делящихся дрожжей, а также у C. neoformans, M. globosa и W. sebi , каждый из которых имеет снижение способности к росту гиф. Семейство белков DOCK (выделитель цитокинеза), которое взаимодействует с белками ELMO, представлено в виде единственной копии гена у мицелиальных грибов и дрожжей. Это семейство содержит ортологи S. cerevisiae DCK1 (гомолог DOCK1 человека), которые, как было показано, влияют на морфогенез гиф ⁷⁰ .Из более широкого семейства белков синдрома Вискотта-Олдрича, которые реорганизуют актиновый цитоскелет во время фагоцитоза, семейство WASP сохраняется у грибов, семейство WAVE представлено только в ранних расходящихся грибах и негрибковых эукариотах, тогда как семейство WASH потеряно. у грибов, с гомологами, обнаруженными только у негрибковых эукариот, что согласуется с недавними сообщениями ^71,72 . Эти паттерны показывают сохранение нескольких фагоцитозных генов у грибов, несмотря на потерю фагоцитоза и эволюцию жестких клеточных стенок и осмотрофии.Предыдущие функциональные анализы показали, что некоторые из сохраненных генов участвуют в морфогенезе гиф у грибов, указывая на то, что члены фагоцитарного аппарата, вероятно, были подвержены многоклеточности гиф у древних грибов.

Эволюционная динамика семейств генов, связанных с фагоцитозом. В мицелиальных грибах сохранилось несколько семейств фагоцитарных генов (DOCK, ELMO, WASP). Семейство WAVE сохранилось только у ранних грибов (Blastocladiomycota и Chytridiomycota), семейство WASH представлено только у негрибковых эукариот.Размер пузыря пропорционален числу копий предкового и существующего гена. Номера копий нитчатых грибов помечены желтым цветом.

Полногеномный скрининг на коррелированную эволюцию между многоклеточностью и расширением семейств генов

Для выявления других семейств генов с потенциальной связью с MC гиф мы систематически искали семейства, которые демонстрируют существенную динамику в узлах BCZ. Мы предположили, что семейства генов, лежащие в основе MC гиф, должны происходить или диверсифицироваться в узлах BCZ и сохраняться у потомков мицелиальных грибов.Поиск семейств генов, соответствующих этим критериям, дал 414 семейств (ANOVA, p <0,05, дополнительная таблица 6), 114 из которых возникли в узлах BCZ, в то время как другие показали уровни дупликации, которые превышали ожидания, полученные из полногеномного сбора семейств генов Рис.4). К ним относятся несколько известных морфогенетических семейств (например, Bgt3, RgsB и Gel2 из A. fumigatus , Bem1 и Rax1 из S. cerevisiae ), гены, участвующие в актиновом цитоскелете и сборке клеточной стенки, спаривании, феромонном ответе (GpaA из A .fumigatus ), споруляции и переносчиков, среди прочего (дополнительная таблица 6). Некоторые из идентифицированных семейств содержат гены с описанными дефектами роста у A. fumigatus или S. cerevisiae , что указывает на то, что в результате наших поисков были обнаружены гены, относящиеся к MC гиф. Например, белки Rax являются главными регуляторами клеточного морфогенеза и участвуют в выборе участка почки у почкующихся дрожжей ^73,74 , поляризованном росте в S. pombe ⁷⁵ и поддержании полярности у нитчатых грибов ⁷⁶ .Открытие, что эти семейства происходят из узлов BCZ, делает их кандидатами на то, чтобы быть ключевыми участниками эволюции MC гиф. Мы также обнаружили грибковый кластер тропомиозинов (TPM1 в S. cerevisiae ), который отображается на MRCA Blastocladiomycota и других грибов и включает гены, участвующие в поляризованном росте и стабилизации актиновых микрофиламентов. Семейство, содержащее гомологов Dip1 S. pombe (Afu6g12370 в A. fumigatus ), появилось в узле, объединяющем Chytridiomycota с высшими грибами, и впоследствии содержит по одному гену на вид, за исключением экспансии в WGD Mucoromycota ⁷⁷ и потерь в Saccharomycotina.В S. pombe , Dip1 активирует комплекс Arp2 / 3 без ранее существовавших актиновых кабелей ^78,79 и, таким образом, инициирует сборку кортикального актинового пятна и эндоцитоз. Поскольку он не требует ранее существовавших актиновых кабелей, он обеспечивает регуляцию актинового цитоскелета посредством механизма, который, по-видимому, специфичен для многоклеточных грибов. Наконец, мы обнаружили семейство, содержащее гомологов S. cerevisiae Dpp1, которое показывает значительное расширение (4 дупликации) в узлах BCZ. Это семейство регулирует морфогенетические переходы у диморфных грибов посредством синтеза сигнальной молекулы грибов farnesol ⁸⁰ , что заставляет нас предположить, что это могло способствовать развитию коммуникации на основе фарнезола у грибов.

Происхождение 414 семейств генов, потенциально связанных с эволюцией тучных клеток гиф, идентифицированных с помощью ANOVA (p <0,05). 114 семейств произошли от узлов BCZ, включая известные белки, связанные с морфогенезом (например, Bgt3, RgsB, Gel2 из A. fumigatus , Rax1, Bem1, Tpm1 и Dpp1 из S. cerevisiae , Dip1 из S. pombe ), помеченные как синие полосы. Красные числа на ветвях представляют количество семейств генов, возникших в основе дерева видов.

Поскольку появление многоклеточности гиф в значительной степени перекрывается с появлением других признаков грибов, трудно однозначно отделить сигналы, передаваемые этими признаками, от сигналов MC гиф.Возможно, что часть из 414 семейств генов (дополнительная таблица 6) была обнаружена из-за сигналов, предоставленных филогенетически совместно распределенными признаками, не обязательно самой многоклеточностью (см. Beaulieu 2016 ⁸¹ для концептуально аналогичной проблемы при анализе таксономической диверсификации) . Одним из таких признаков может быть осмотрофия, механизм питания грибов для поглощения растворимых продуктов, генерируемых внеклеточными ферментными комплексами ⁸² . Мы обнаружили 20 семейств генов, которые показали сильную корреляцию с MC гиф и были аннотированы как различные переносчики; такие семьи гипотетически могут быть связаны с осмотрофией.Кроме того, среди 414 обнаруженных семейств было 84, которые в настоящее время функционально не охарактеризованы, и поэтому невозможно строить предположения об их роли в MC гиф. В совокупности эти семейства указывают на то, что существует множество грибковых генов, которые эволюционировали вместе с MC гиф и которые ждут функциональной характеристики, чтобы установить связи с MC гиф или другими функциями грибов.

Развитие репертуаров киназ, рецепторов и адгезивов не коррелирует с многоклеточностью гиф

Усложнение межклеточных коммуникаций и путей адгезии часто коррелирует с расширенным репертуаром генов, кодирующих киназы, рецепторы и адгезивные белки ^83–85 .Поэтому мы исследовали гены Ser / Thr-киназы (954 кластера), гибридной гистидинкиназы (96 кластеров), рецептора (183 кластера) и адгезии (23 кластера), сосредоточив внимание на сравнении одноклеточных и нитчатых грибов. Число копий в 954 идентифицированных кластерах киназ Ser / Thr было сходным у одноклеточных и простых многоклеточных грибов, при этом более высокое разнообразие киназ обнаружено в сложных многоклеточных Basidiomycota (по данным Krizsan 2018) ⁸⁶ и Rhizophagus irregularis (рис.5а). Мы предположили чистые сокращения в узлах BCZ от 572 до 529 реконструированных предковых киназ (81 дупликация, 124 потери, Рис. 5a). Тем не менее, семейства киназ, которые здесь продублированы, включают все 3 пути MAPK у грибов, феромон спаривания, целостность клеточной стенки ( fus3, kss1, kdx1 из S. cerevisiae, mpkB из A. fumigatus ) и осморегуляторные пути ( hog1, ssk2, ssk22 из S. cerevisiae, sakA, sskB из A. fumigatus ), все из которых косвенно регулируют рост гиф ^46–48 .

Эволюция семейства генов серин-треонинкиназ (а), трансмембранных рецепторов (б) и генов, связанных с адгезией (в). Узлы BCZ (желтые) представляют собой предполагаемое происхождение MC гифы. Размер пузыря на дереве пропорционален реконструированному числу копий предкового гена и количеству копий существующих видов (показано справа на дереве). Графики скрипки для киназ (а) и рецепторов (b) показывают распределение числа копий семейств генов в многоклеточных грибах (серый) и многоклеточных (зеленый).

В целом, у грибов было меньше Ser / Thr-киназ (в среднем 257), чем у многоклеточных (в среднем 643).Однако более высокое разнообразие киназ многоклеточных, по-видимому, является результатом ранней экспансии MRCA Holomycota и Holozoa (Fig. 5a). В то время как требования трансдукции сигнала MC многоклеточных животных в основном обсуждались в контексте рецепторных тирозинкиназ, мы не нашли доказательств доменной архитектуры, типичной для рецепторных тирозинкиназ у грибов. Единственная группа, напоминающая рецепторные киназы, — это гибридные гистидинкиназы (HK), которые включают белки с сенсорным доменом, гистидинкиназным доменом и C-концевым принимающим доменом, который действует как регулятор ответа.Мы сделали вывод об экспансии (24 дупликации, 10 потерь) HKs в MRCA Chytridiomycota и других грибов, включая HK класса III и X, которые связаны с морфогенезом ^87,88 . Другая волна экспансии HK была обнаружена в MRCA Mucoromycota и Dikarya с 11 дупликациями и 4 потерями (дополнительный рис. 3).

Реконструкции числа копий предковых генов гистидинкиназных генов. Цифры на ветвях обозначают дупликации (+) и потери (-) генов, полученные с помощью СРАВНЕНИЯ.Размер пузыря пропорционален реконструированному числу копий предкового гена. Распределение количества копий для каждого вида показано справа от дерева.

В рецепторах, связанных с G-белком (GPCR), еще более резкое различие наблюдалось между грибами и многоклеточными животными (рис. 5b). У последних наблюдалась большая экспансия рецепторов, что привело к образованию 135-583 генов у современных животных. Из 183 проанализированных семейств GPCR только 19 были обнаружены у грибов, и только одно из них в целом сохранялось у грибов.Это семейство содержит STE3 и STE3-подобные рецепторы феромона а-фактора, участвующие в феромон-зависимой передаче сигнала, клеточной конъюгации и слиянии клеток.

Белки адгезивной клеточной поверхности являются ключевыми медиаторами перехода к MC в колониальных и агрегативных клонах ^3,5,6 , что отражается в их более высоком количестве копий в многоклеточных организмах ⁸⁹ . Мы идентифицировали 45 семейств предполагаемых связанных с адгезией белков у грибов, включая адгезины, флоккулины, гидрофобины, различные лектины и гликозилфосфатидилинозитол (GPI) -якоренные белки клеточной стенки.Наши реконструкции эволюции этих семейств (рис. 5c) выявили не расширение, а небольшое сокращение (с 17 до 14 копий) в узлах BCZ. Расширение предполагалось у дрожжей Agaricomycotina и Saccharomycotina ( C. albicans, P. stipitis, hansenii ). Экспансия Agaricomycotina была вызвана гидрофобинами класса 1 и гомологами C. neoformans Cfl1 (адгезивный белок, играющий роль в передаче сигналов и регуляции морфогенеза) ⁹⁰ . Диверсификация этих семейств коррелирует с эволюцией плодовых тел и, вероятно, отражает появление сложной многоклеточности ⁷ .Более высокое количество копий у видов дрожжей относится к нескольким дрожжевым адгезинам и лектин-подобным белкам клеточной стенки, которые содержат экспериментально охарактеризованные адгезивные белки патогенных грибов человека (например, Candida spp.) ^91,92 .

В совокупности эволюция репертуаров киназ, рецепторов и адгезивных белков подчеркивает важное различие между грибами и другими многоклеточными клонами. Мы не наблюдали значительного распространения таких семейств у мицелиальных грибов, тогда как гены, связанные с киназой и адгезией, увеличивались в сложной многоклеточной Agaricomycotina.Это может быть объяснено двухэтапным характером эволюции сложных MC у грибов ^7,93 , которая проходит через промежуточный уровень сложности, гиф MC, в отличие от многоклеточных животных, где сложные MC эволюционировали более прямым путем ¹⁴ .

Дрожжи сохраняют большинство генов, необходимых для морфогенеза гиф

Дрожжи — это вторично упрощенные организмы с пониженной способностью образовывать гифы, которые проводят большую часть своего жизненного цикла как одноклеточные ^16,18,53,94 .Наши реконструкции состояния предков предполагают, что дрожжи произошли от нитчатых предков (рис. 1а), и, таким образом, они представляют собой классический пример уменьшенной сложности. Была выдвинута гипотеза, что они потеряли MC ⁹⁵ , хотя рудиментарные формы роста гиф (называемые псевдогифами) существуют у большинства видов. Мы тщательно изучили судьбу генов, связанных с MC, в пяти преимущественно дрожжевых линиях: ⁹⁴ , Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Pucciniomycotina, Ustilaginomycotina и Tremellomycotina.Поскольку геномы дрожжей претерпели чрезвычайную оптимизацию в ходе эволюции, мы оценили потерю генов среди генов, связанных с MC, по сравнению с общегеномными цифрами потери генов.

Виды дрожжей обычно имеют меньше генов, связанных с MC, и реконструкции указывают на большие потери, чем дупликации вдоль ветвей предков дрожжей (рис. 6). Однако, когда мы скорректировали сокращение числа генов по всему геному, мы обнаружили, что гены морфогенеза гиф недостаточно представлены среди потерянных генов по сравнению с другими функциями (рис.6а, дополнительная таблица 7). Большинство групп генов морфогенеза гиф значительно истощены (P <0,05, точный критерий Фишера) среди потерь генов в кладах дрожжей (за исключением Ustilaginomycotina). Мы выявили только 6 случаев, когда потери генов, связанных с MC, были значительно превышены (P <0,05, точный тест Фишера, дополнительная таблица 7) в белках, связанных с адгезией и транспортом на основе микротрубочек. Более высокая, чем ожидалось, скорость потери таких белков наблюдалась у Taphrinomycotina, Pucciniomycotina, Tremellomycotina и Saccharomycotina, что позволяет предположить, что функции транспорта и адгезии, связанные с микротрубочками, становятся незаменимыми для этих кладовых дрожжей.Потери в «системе микротрубочек» особенно интересны с точки зрения дальнего транспорта пузырьков и ядер по гифам. Связанные с системой микротрубочек гены со сниженным репертуаром у дрожжей включают белки комплекса гамма-тубулин, кинезины, динактин, тяжелую цепь динеина (nudA) и связывающий динактин белок ro-2 ⁹⁶ . Из пяти дрожжеподобных кладов почкующиеся и делящиеся дрожжи демонстрируют наибольшие потери генов, что согласуется с самым сильным снижением способности роста гиф в этих кладах.Аналогичная картина была обнаружена для НАДФН-оксидаз, что согласуется с предыдущими сообщениями: одновременные потери во всех дрожжеподобных кладах с полной потерей семейства у Saccharomycotina, Ustilaginomycotina, у S. pombe и C. neoformans ( Дополнительный рис. 4).

Реконструкции числа копий предковых генов НАДФН-оксидазных генов. Цифры на ветвях обозначают дупликации (+) и потери (-) генов, полученные с помощью СРАВНЕНИЯ. Размер пузыря пропорционален реконструированному числу копий предкового гена.Распределение количества копий для каждого вида показано справа от дерева.

Вторично упрощенные дрожжеподобные грибы сохраняют гены ТЦ гиф. (а) процент потерянных генов в основных категориях, связанных с морфогенезом. Проценты были рассчитаны относительно числа предковых копий, выведенных в узле, предшествующем происхождению 5 дрожжеподобных клад (Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Pucciniomycotina, Ustilaginomycotina и Tremellomycotina). Значимость увеличения потерь генов в каждой категории по сравнению с общегеномными цифрами потери генов была определена с помощью точного теста Фишера и показана над столбиками.(b) реконструкция числа копий предкового гена транспортных генов на основе микротрубочек вдоль филогении грибов. Желтым цветом выделены вторично упрощенные (дрожжевые) клады. Размер пузырька пропорционален реконструированному числу копий предкового и существующего гена в 19 генных семействах. Распределение количества копий каждого семейства генов показано справа на дереве.

Всего в геномах дрожжей сохранялось 54-65% генов, связанных с MC (дополнительная таблица 7). Например, практически не наблюдается снижения количества связывающих белков PI4,5P2 (Slm1, Slm2 в S.cerevisiae ⁹⁷ ), которые участвуют в регуляции организации актинового цитоскелета и эндосомного транспорта, или в миозинах класса I (myoA в A. nidulans ⁹⁸ , myo5 в S. cerevisiae ⁹⁹ ), которые локализуются в месте поляризованного роста и участвуют в секреции и биогенезе клеточной стенки.

В совокупности эти данные указывают на то, что гены морфогенеза гиф в целом необязательны для дрожжей в меньшей степени, чем гены с другими функциями.Это согласуется с тем, что большинство дрожжеподобных грибов способны переключаться на рост гиф или псевдогифа при определенных условиях. Однако тот факт, что гены морфогенеза гиф статистически значимо не обогащены среди потерь по сравнению с общегеномным ожиданием, не противоречит снижению способности многоклеточных грибов у дрожжеподобных грибов. Эти потери генов действительно указывают на снижение роста гиф, хотя это сокращение меньше по сравнению с другими функциями в геноме. Это, в свою очередь, предполагает, что способность к многоклеточному росту входит в число функций, которые преимущественно сохраняются у дрожжеподобных грибов.

Выводы

Мы проанализировали генетические основы эволюции гиф грибов. Гифы являются одними из самых загадочных грибных структур с уникальной многоклеточной организацией, но их эволюционное происхождение остается малоизученным. Наши реконструкции состояния предков локализовали происхождение гиф в трех узлах вокруг разделения Blastocladio-, Chytridio- и Zoopagomycota (узлы BCZ), что согласуется с предыдущими исследованиями ¹⁷ и потенциальной конвергенцией гифоподобных структур в этих типах.

Чтобы понять, как развивалась лежащая в основе генетика, мы идентифицировали 362 семейства генов, имеющих известное отношение к морфогенезу гиф (например, из нокаут-исследований), и предсказали связь с MC гиф для других 414 семейств, используя сравнительную геномику 71 вида. Эволюционная динамика этих семейств показывает неоднозначную картину. Большая часть семейств сохраняется у всех отобранных эукариот и демонстрирует очень небольшую динамику числа копий или вообще не демонстрирует ее у происхождения многоклеточных грибов.Вторая категория включает семейства генов с глубоким эукариотическим происхождением, дупликации которых совпадают с эволюцией гиф. Однако не было обнаружено семей, которые имели бы статистически значимо повышенное количество дупликаций в узлах BCZ, что указывает на ограниченную эволюционную новизну в этих узлах. К третьей категории относятся семейства генов, происхождение которых сопоставлено с узлами BCZ (семейства RGS, формины, APSES и Bem1). Такие семейства генов могли развиться de novo или разойтись по последовательностям настолько, что сходство с гомологичными не грибковыми последовательностями невозможно обнаружить.Мы находим кандидатов для обоих сценариев. Например, семейства MedA или APSES содержат специфичные для грибов белковые домены; они предположительно развились в ранних грибах и представляют собой специфические для грибов инновации. С другой стороны, обнаруженные семейства форминов и RGS содержат только гены грибов, но их характерные домены Interpro встречаются и за пределами грибов, возможно, отражая общее происхождение, с доказательствами гомологии, размытыми дивергенцией последовательностей.

Мы обнаружили, что несколько генов, связанных с многоклеточностью, предшествовали появлению MC гиф и кооптировались для роста гиф во время эволюции, что отражает закономерности, наблюдаемые у многоклеточных животных и растений ^6,100,101 .Такие наблюдения приводят к гипотезе о том, что с точки зрения генетической новизны переход к многоклеточности представляет собой второстепенный, а не главный этап эволюции ¹⁰² , идея, которая находит поддержку в проведенных здесь наблюдениях на грибах. Поддержание клеточной полярности, перенос пузырьков и цитоскелетные системы одноклеточных эукариот, возможно, оказались полезными функциями в MC гиф, на которых в ходе эволюции мог быть построен экстремально поляризованный рост гиф грибов. Механизм фагоцитоза, вероятно, был заменен на MC гиф: его первоначальная функция, скорее всего, была отменена появлением жесткой клеточной стенки у ранних грибов, что, вероятно, сделало необязательными лежащие в основе гены.Однако вместо того, чтобы теряться со временем, его компоненты были включены в ТЦ гифы.

Наконец, помимо событий в семействе генов, определенно другие генетические механизмы (например, изменения аминокислотной последовательности и состава доменов, изменения биофизических свойств генов) также внесли свой вклад в эволюцию гиф. Наш анализ архитектуры генов выявил значительные различия между MC-родственными генами одноклеточных и многоклеточных грибов, указывая на то, что изменения в длине CDS или содержании интронов также имеют отношение к появлению гиф MC ¹⁰³ .Также были опубликованы сообщения об изменениях на уровне последовательностей и перетасовке доменов в связи с эволюцией MC гиф. Имеются доказательства того, что кинезины грибов в 2 раза более процессивные, чем кинезины других эукариот ¹⁰⁴ — вероятно, в ответ на потребность в транспорте на большие расстояния вдоль оси гиф. Сходным образом хитинсинтазы классов V и VII приобрели миозиновый моторный домен у ранних грибов, обеспечивая более высокую эффективность в синтезе поляризованного хитина ^105-107 .

Взятые вместе, наши результаты предполагают, что множественные механизмы, вероятно, способствовали эволюции MC гиф, включая изменения в структуре генов, дупликации генов, de novo рождение семейства генов и коопцию / неофункционализацию.По сравнению с другими многоклеточными линиями эволюция грибов демонстрирует несколько уникальных закономерностей. Хотя расширение механизмов адгезии и передачи сигнала характерно для большинства колониальных и агрегативных многоклеточных клонов, исследованных до сих пор ^{3,9,19,108–110} , мы не нашли доказательств этого у грибов. Это можно объяснить своеобразной историей жизни гиф грибов, которые имеют сходство только с Oomycota. Хотя адгезия может не быть ключевой для вегетативных гиф, существует множество доказательств активной коммуникации между соседними гифами ^111–113 .Возможно, что основные способы коммуникации в гифах грибов не связаны с рецепторами клеточной поверхности, могут быть связаны с летучими веществами (такими как фарнезол ^80,114,115 ) или еще не известны. Эти наблюдения предполагают, что многоклеточность грибов значительно отличается от таковой в других линиях и повышает возможность того, что MC гифы следует рассматривать как третий, качественно отличный способ в дополнение к агрегатным и клональным способам эволюции MC. Помимо субъективных категорий, MC гиф представляет собой очень успешную адаптацию к наземной жизни, и сравнительная геномика открывает дверь для дискуссий о том, представляют ли основные фенотипические переходы — с точки зрения генетической новизны — основной или второстепенный переход.

Методы

Организменная филогения

Мы собрали набор данных, содержащий полные протеомы 71 вида, и выполнили анализ «все против всех», используя mpiBLAST 1.6.0 ¹¹⁶ . Мы исключили микроспоридии из набора данных из-за высокой скорости эволюции этой группы. Белки были кластеризованы в семейства генов с помощью алгоритма кластера Маркова (MCL) ¹¹⁷ с параметром инфляции 2,0. Кластеры с заполнением таксоном не менее 50% были выбраны и выровнены по PRANK 140603 ¹¹⁸ в то время как trimAl 1.4.rev15 ¹¹⁹ использовали для удаления плохо выровненных областей из множественных выравниваний последовательностей с использованием параметра –gt 0.2. Деревья генов с приблизительным максимальным правдоподобием были выведены FastTree ¹²⁰ с использованием модели LG + CAT (-lg -cat20) и опции -gamma для вычисления вероятностей на основе Gamma20. Используя специально созданный Perl-скрипт, мы исключили генные деревья с глубокими паралогами, чтобы идентифицировать гены-единственные копии. Выравнивания кластеров генов с одной копией объединяли в суперматрицу, и дерево видов оценивали с помощью RAxML 8.2.4 ¹²¹ под модель PROTGAMMAWAG. Модель была разделена по генам. Начальная загрузка была выполнена для набора данных в 100 повторах.

Реконструкции состояния предков

71 вид был закодирован на основании их способности образовывать гифы, как гифы, так и не гифы. Виды, которые нельзя было однозначно отнести к гифам или не гифам ( Catenaria anguillulae ), а также виды со способностью расти как гифы или одноклеточные (большинство дрожжевых грибов), были закодированы как неопределенные.Байесовская реконструкция состояний предков с помощью MCMC была выполнена в рамках пороговой модели ¹²² с использованием байесовской MCMC с функцией «ancThresh» в phytools v0.6-60 ¹²³ в R ¹²⁴ . Количество поколений MCMC было установлено равным 1 000 000, и метод «mcmc» использовался с броуновским движением в качестве модели для эволюции ответственности. Параметр выгорания был установлен по умолчанию. Сходимость проверялась путем анализа значений вероятности во времени.

Анализ эволюции семейств генов

Чтобы исследовать эволюционную динамику семейств генов, содержащих гены, связанные с морфогенезом гиф, мы выполнили бластный анализ всех против всех (NCBI Blast 2.7.1+) ¹²⁵ для протеомов 71 вида и провели кластеризацию белков на основе сходства последовательностей, следуя протоколу кластеризации MCL ¹¹⁷ , используемому Ohm et al 2012 ¹²⁶ . Полученные кластеры белка были выровнены с помощью PRANK 140603 ¹¹⁸ с параметрами по умолчанию, а неоднозначно выровненные области были удалены с помощью trimAl 1.4.rev15 ¹¹⁹ с аргументом –gt 0.2. MAFFT v7.222 ¹²⁷ (опция –-auto) использовался в качестве альтернативного инструмента выравнивания для кластеров, которые не удалось выровнять с помощью PRANK из-за вычислительных ограничений (80 кластеров из 34032).Вывод максимального правдоподобия для деревьев генов и расчет значений поддержки ветвей, подобных Shimodaira-Hasegawa, выполняли в RAxML 8.2.4 ¹²⁸ в рамках модели эволюции белка PROTGAMMAWAG. Рассчитанные значения поддержки SH-подобных ветвей были использованы при согласовании генов деревьев и видов деревьев в Notung-2.9 ¹²⁹ . Был использован порог краевого веса 0,9, так как SH-подобные значения поддержки обычно менее консервативны, чем значения начальной загрузки ML (где 70% обычно принимается как показатель сильной поддержки).Согласование было выполнено на деревьях генов максимального правдоподобия и на дереве видов ML для 71 вида в качестве входных данных. Мы реконструировали динамику дупликации / потери генов семейств генов вдоль дерева видов, используя соответствующие скрипты из конвейера COMPARE ^94,130 . Количество прибылей и убытков для каждого семейства генов и для каждой ветви дерева видов было записано и нанесено на карту на дереве видов. Число копий генов предков было рассчитано для каждого внутреннего узла, суммируя картированные дупликации и потери по дереву видов.Сопоставления были созданы для каждой из функциональных групп, а также для киназ, белков, связанных с адгезией, рецепторов, а также для всех семейств генов в 71 геноме.

Чтобы проверить, испытывают ли гены, связанные с MC гиф, эпизод повышенной скорости дупликации в узлах, где предположительно возник рост гиф (узлы BCZ), мы выполнили анализ обогащения дупликации генов для каждого из 362 семейств и функциональных групп. Чтобы проверить, показывает ли кластер или функциональная группа значительно большее или меньшее количество дубликатов, чем ожидалось случайно, в узлах BCZ, мы запускаем двусторонние точные тесты Фишера (p <0.05). Мы сравнили количество дупликаций, отображаемых в узлах BCZ для данного семейства генов, с общегеномным количеством дупликаций в узлах BCZ, используя общее количество дупликаций по дереву в качестве ориентира.

Анализ ключевых генов, связанных с многоклеточностью

Вышеупомянутая стратегия была использована для реконструкции эволюции семейств киназных, рецепторных и связанных с адгезией генов. Кластеры белков, содержащие гены киназ, как серин-треонинкиназы, так и гистидинкиназы, были собраны на основе доменов InterPro.Идентификация серин-треонинкиназ и гистидинкиназ последовала за Park et al 2011 ¹³¹ и Herivaux et al 2016 ⁸⁸ соответственно. Классификация гистидинкиназ последовала Defosse et al. ⁸⁷ .

Семейства адгезивных белков были идентифицированы на основе экспериментально охарактеризованных генов, собранных из литературы. Мы идентифицировали 45 генов, которые в основном сгруппированы в флоккулины, лектины, гидрофобины и другие адгезины клеточной стенки, модифицированные (GPI).Мы идентифицировали гены рецепторов на основе доменов InterPro, которые аннотированы термином онтологии гена «рецепторная активность» (но не «рецепторное связывание» или другими терминами, указывающими на косвенную связь с функцией рецептора), в результате получено 27 терминов IPR (IPR000161, IPR000276, IPR000337). , IPR000363, IPR000366, IPR000481, IPR000832, IPR000848, IPR001103, IPR001105, IPR001499, IPR001546, IPR001946, IPR002011, IPR002185, IPR002280, IPR002455, IPR002456, IPR003110, IPR003292, IPR003980, IPR003982, IPR005386, IPR006211, IPR017978, IPR017979, IPR017981).

Анализы генов, связанных с фагоцитозом

Мы собрали информацию о генах, связанных с фагоцитозом из недавних обзоров Dictyostelium ^65,66 , идентифицировали соответствующие гены этого вида в нашем наборе данных и белковые кластеры, содержащие гомологи идентифицированные гены. Картирование дупликаций и потерь генов вдоль дерева видов было выполнено, как описано выше.

Полногеномный скрининг предполагаемых семейств генов, связанных с многоклеточностью гиф

Для выявления семейств генов с повышенной частотой дупликации генов, совпадающей с происхождением MC гиф, мы создали конвейер, который проверяет более высокую, чем ожидалось, скорость дупликации в узлах дерева видов, к которому можно было отнести происхождение гиф (узлы BCZ).Для каждого семейства генов уровни дупликации генов в узлах BCZ сравнивали с коэффициентами дублирования того же семейства в других частях дерева видов (узлы до и после узлов BCZ). Частота дупликации генов вычислялась путем деления количества реконструированных дубликатов для данной ветви на длину этой ветви с использованием специального сценария Perl. Терминальные дупликации и дупликации, сопоставленные с предками многоклеточных животных, были исключены из анализа. Результирующая матрица частоты дублирования узлов × была проанализирована с помощью двухфакторной перестановки ANOVA ¹³² со степенями свободы DFT = 2, в R, с P <0.05 считается значимым. Мы также потребовали, чтобы обнаруженные кластеры были сохранены (> = 1 копия) по крайней мере в 70% нитчатых грибов.

Анализ потерь генов у дрожжеподобных грибов

Мы проанализировали потери генов в пяти дрожжеподобных линиях, сравнив количество потерь в масштабе всего генома с количеством потерь в генах, связанных с морфогенезом гиф (регуляция актинового цитоскелета, поддержание полярности). , биогенез / ремоделирование клеточной стенки, перегородка и закупорка перегородки, трансдукция сигнала, регуляция транскрипции, транспорт везикул, транспорт на основе микротрубочек и регуляция клеточного цикла) относительно числа предковых копий.P-значения рассчитывались с помощью точного критерия Фишера, при этом P <0,05 считалось значимым. Процент генов, сохраняющихся в геномах дрожжей, был рассчитан для каждой функциональной категории путем сравнения числа копий древнего гена до появления дрожжевых линий со средним числом копий гена на концах.

Статистический анализ геномных особенностей

R-скрипт (доступен по запросу) был написан для генерации кодирующей последовательности (CDS) / статистики интронов (цепочка, порядок, длина, количество) на основе аннотаций генома 71 вида.Координаты признаков CDS для каждого гена были извлечены и впоследствии использованы для расчета координат интрона. Статистическая значимость различий между длиной гена, CDS и интронов 4 одноклеточных и 39 многоклеточных грибов была исследована с помощью независимого двустороннего t-критерия Велча с оценкой объединенной дисперсии (var.equal = FALSE) с использованием функции t.test в R.

Способность C. albicans изменять форму может способствовать возникновению опасных инфекций, и исследование показывает, что этому переходу способствует белок Sir2 — ScienceDaily

Candida albicans можно назвать оборотнем: по мере роста этого грибка , он может размножаться как одиночные клетки овальной формы, называемые дрожжами, или размножаться в удлиненной форме, называемой гифой, состоящей из нитевидных волокон.

Эта двойная природа может помочь патогену выжить в организме, где он может вызвать заболевание, в том числе опасные внутрибольничные инфекции.

Но как возникает эта переключающая способность?

Новое исследование определяет один фактор, который может внести свой вклад. В исследовании, которое будет опубликовано 5 мая в журнале mSphere , биологи из Университета Буффало Гуолей Чжао и Лаура Руш сообщают, что белок Sir2 может способствовать переходу C. albicans от яйцевидных дрожжей к нитевидным гифам. Клетки C. albicans , у которых отсутствовал ген Sir2, в лабораторных экспериментах с меньшей вероятностью образовывали настоящие гифы, чем клетки того же вида, у которых был этот ген.

«Когда мы избавились от гена Sir2, мы увидели меньше истинной формы гиф», — говорит Чжао, первый автор и кандидат биологических наук в Колледже искусств и наук UB. Это интересно, говорит она, потому что и «крошечная круглая форма дрожжей», и «удлиненная форма гиф» «необходимы для заражения», помогая C.albicans вторгаются в различные ниши человеческого тела.

Влияние Sir2 на морфологию различается в зависимости от окружения клеток: в среде с низким содержанием питательных веществ клетки C. albicans , у которых отсутствовал ген Sir2, с меньшей вероятностью формировали как настоящие гифы, так и псевдогифы, своего рода ин- между стадиями, когда клетки удлиняются и растут цепочками. Но в ситуации, богатой питательными веществами, C. albicans , лишенный гена Sir2, образовывал больше псевдогиф, даже когда образование настоящих гиф снижалось.

Необходимы дополнительные исследования, чтобы понять, почему именно это могло произойти, но «очевидно, что питательная среда изменяет поведение клеток», — говорит Руш, доктор философии, доцент биологических наук UB.

Руш объясняет, что различные факторы окружающей среды, такие как доступность питательных веществ и температура, влияют на то, принимает ли C. albicans дрожжевую или нитчатую форму. По ее словам, Sir2, который принадлежит к семейству белков, называемых сиртуинами, может влиять на этот процесс, помогая клеткам интерпретировать и / или реагировать на то, что происходит во внешнем мире.

«С нашей точки зрения, важно то, что в любом из состояний — богатых питательными веществами или бедных питательными веществами — отсутствие гена Sir2 изменило баланс, что означает, что сигнал, который передает белок Sir2, является важной частью уравнения. , — говорит Руше. «Клетки объединяют много информации, чтобы« решить », какую форму принять. Более подробная информация о том, что запускает выбор, может позволить нам модулировать его в будущем. Если вы сможете уменьшить способность Candida albicans генерировать нитевидную форму, возможно, вы может сделать его менее заразным.«

Чтобы узнать больше о том, как Sir2 может влиять на формирование гиф, Руш и Чжао внимательно изучили различные аспекты биологии C. albicans ‘. Среди других результатов ученые показали, что белок Sir2 локализован в ядре клеток C. albicans ‘, и что удаление гена Sir2 из C. albicans привело к снижению активности некоторых генов, которые обычно очень активен в клетках гиф.

Исследователи также пришли к выводу, что одна из ключевых функций белка Sir2 — удаление ацетильной группы из других белков — вероятно, участвует в облегчении перехода в гифы.В экспериментах нарушение этого процесса деацетилирования привело к образованию меньшего количества настоящих гиф.

«Sir2 — это белок, который я изучал в течение 20 лет, поэтому он долгое время был в центре моих исследований», — говорит Руш. «Нас интересовало, как он выполняет разные функции у разных видов. Мы решили, что было бы интересно взглянуть на белок Sir2 у Candida albicans, потому что он имеет медицинское значение, и мы хотели узнать, что наши знания об этом белке могут помочь. узнаем о возбудителе.«

«Меня интересуют патогенные виды, — говорит Чжао. «Белок Sir2, кажется, оказывает этот эффект при морфологическом переходе между дрожжевой и гифальной формой. Мы думаем, что этот переход может повлиять на вирулентность этого человеческого патогена, так что это очень важно».

Исследование было поддержано грантом пилотного проекта от UB Genome, Environment and Microbiome Community of Excellence.

История Источник:

Материалы предоставлены University at Buffalo .Оригинал написан Шарлоттой Сюй. Примечание: содержимое можно редактировать по стилю и длине.

Как работают микоризы? Просто объяснил

Приходилось ли вам когда-нибудь работать в саду или просто выращивать одно растение? Если да, то вы знаете, что это тяжелая работа — вы должны тщательно выращивать рост, не допуская сорняков и обеспечивая растение большим количеством воды и солнечного света. В конце вы будете вознаграждены обилием полезных питательных веществ в виде вкусных свежих овощей или прекрасных цветов.Но знаете ли вы, что у многих растений тоже есть свои сады? Однако, в отличие от наших садов, сады растений находятся полностью под землей, и обычно вы никогда их не видите, за исключением короткого периода в году. Их называют микоризы (my-coh-rise-eh), и они живут в симбиотических отношениях с самим растением.

Что такое микориза?

На самом деле микоризы — это гриб. Они существуют в виде крошечных, почти или даже полностью микроскопических нитей, называемых гифами .Гифы все связаны в сетчатую паутину, называемую мицелием , которая измеряется в сотнях или тысячах миль — все они упакованы в крошечный участок вокруг растения.

Мицелий одной микоризы (примечание: микориза — множественное число), в свою очередь, может распространяться наружу, соединять несколько растений (даже растения разных видов!) И даже соединяться с другими микоризами, образуя подземное сусло, подобное Франкенштейну. -up позвонила в общую микоризную сеть .

В обычной микоризной сети трудно сказать, где заканчивается одна микориза и начинается другая. Благодаря этой обширной сети одно растение может быть соединено с совершенно другим видом растений на полпути через лес!

Микориза на самом деле соединяется с растениями двумя способами. Одна форма, называемая эктомикориза , просто окружает корни снаружи. Другая форма, называемая endomycorrhizae , на самом деле растет внутри растения — их гифы протискиваются между клеточной стенкой и клеточными мембранами корней (как бы вклиниваясь между велосипедной шиной и внутренней камерой).

В нормальных условиях вы вряд ли увидите микоризы, потому что они такие маленькие. Но время от времени происходит что-то удивительное: микоризы воспроизводят и посылают плодовые тела, которые производят споры — мы называем их грибами! Некоторые из этих грибов даже съедобны, например трюфели или лисички.

Как растения помогают микоризе?

Из растений получаются отличные садовники. Так же, как мы удобряем наши сады, растения питаются микоризами.Растения заберут излишки сахара, образующиеся в листьях в процессе фотосинтеза, и отправят его к корням. Отсюда микориза может поглощать его, чтобы поддерживать себя. Под землей очень мало солнечного света, и даже если бы он был, микоризы не смогли бы собирать его, как растения, потому что у них нет оборудования, необходимого для фотосинтеза. Сахар из растений буквально поддерживает жизнь микоризы.

Как микориза помогает растениям?

Растения не отказываются от своих ценных ресурсов сахара только ради удовольствия выращивать грибные сады.Они получают много полезного от микоризы, в основном в виде питательных веществ.

Растения могут сами получать питательные вещества через корни, но имеют ограниченные возможности для этого. Их корни должны находиться в прямом контакте с почвой, чтобы впитывать питательные вещества, а корни растений вырастают очень маленькими. С другой стороны, грибы могут стать намного меньше. Гифы грибов могут вклиниваться между отдельными частями почвы, покрывая почти каждый доступный кубический миллиметр почвы. Это увеличивает площадь поверхности и дает растениям гораздо больший доступ к питательным веществам, чем они могли бы получить сами по себе.Многие растения, живущие в тяжелых условиях, вообще не смогли бы выжить без микоризы.

Микориза поглощает питательные вещества, такие как фосфор и магний, и доставляет их прямо к корням растений. Здесь они обменивают собранные питательные вещества на сахар. Это честная торговля, и обе стороны выигрывают.

Кроме того, микориза помогает растениям множеством других способов. Микориза помогает защитить растения от болезней и токсинов.Микориза также может служить службой доставки сахара, когда растения доставляют сахар туда и обратно к разным растениям, подключенным к одной и той же общей микоризной сети. Пожалуй, что самое странное, общая микоризная сеть может также служить средством для растений «разговаривать» друг с другом — Интернет, сделанный из грибов!

Собираем все вместе

Микоризы составляют неоценимую часть экосистем по всему миру, и их можно найти в той или иной форме практически в любой экосистеме.Во многих местах целые леса и экосистемы вообще не существовали бы без их микоризных друзей.

В следующий раз, когда вы гуляете по лесу и увидите гриб, растущий из земли, будьте благодарны и помните, что целый мир гудит у вас под ногами.

Формы и их характеристики

Главная страница >> Формы и их характеристики >> Как классифицируются формы >> Где найти формы >> Как изолировать плесень >> Как выращивают плесень >> Загрязнение >> Формы под микроскопом >> Как идентифицируются плесени >> Указатель описаний >> Библиография

Плесень, эти маленькие пыльные пятна, которые часто можно найти на хлебе, сыре, книгах и других предметах в доме, ежегодно приводят к потере миллионов долларов для нашей экономики и, что еще хуже, могут представлять угрозу для вашего здоровья.Чтобы успешно справиться с ними, мы должны понимать, что такое формы и что именно они делают.

Плесень — это микроскопические организмы, похожие на растения, состоящие из длинных нитей, называемых гифами . Гифы плесени растут на поверхности и внутри почти всех веществ растительного или животного происхождения. Из-за своей нитчатой ​​структуры и постоянного отсутствия хлорофилла большинство биологов считает, что они отделены от царства растений и членов царства грибов.Они родственны знакомым грибам и поганкам, отличаются только тем, что их нити не объединены в большие плодовые структуры. Для наших целей мы будем рассматривать в качестве плесневых грибов только те грибы, которые обычно встречаются дома и в лаборатории и которые легко выращивать и изучать.

Когда гифы плесени достаточно многочисленны, чтобы их можно было увидеть невооруженным глазом, они образуют ватную массу, называемую мицелием . Это гифы и образующийся мицелий, которые проникают в наши дома и вызывают их разложение.

Размножение грибов сложное и включает большое разнообразие структур. На самом фундаментальном уровне можно сказать, что большинство плесневых грибов воспроизводят спор . Споры подобны семенам; они прорастают, чтобы произвести новую колонию плесени, когда они приземляются в подходящем месте. В отличие от семян, они очень просты по структуре и никогда не содержат зародыша или какого-либо предварительно сформированного потомства. Споры образуются по-разному и имеют поразительное множество форм и размеров. Несмотря на это разнообразие, споры довольно постоянны по форме, размеру, цвету и форме для любой данной плесени и, таким образом, очень полезны для идентификации плесени.

Основное различие между спорами заключается в их способе инициирования, который может быть половым или бесполым. Споры, инициированные половым путем, возникают в результате спаривания двух разных организмов или гиф, тогда как споры бесполого происхождения возникают в результате простого внутреннего деления или внешней модификации отдельной гифы. Распознавание спаривания и последующее образование спор часто затруднено для наблюдателя и обычно остается за пациентами-специалистами. Однако для практических целей можно научиться распознавать определенные признаки полового процесса, а именно четыре вида определяемых половым путем спор, которые появляются у плесневых грибов: (1) ооспоры, (2) зигоспоры, (3) аскоспоры и (4) ) базидиоспоры.

Ооспоры (рис. 1) образуются, когда мужские гаметы (репродуктивные ядра) входят в большую сферическую клетку ( oogonium ) и оплодотворяют яйца внутри. Результат, как видно при обычном осмотре, — многочисленные оогонии, содержащие от одного до нескольких сферических и часто коричневатых яиц. Оогонии обычно пронизаны одной или несколькими гифами ( антеридии ), дающими начало мужским ядрам.

Зигоспоры (рис. 2 и иллюстрация зигоспор) не встречаются внутри какой-либо ограждающей структуры, а образуются путем прямого слияния двух выступов гиф ( суспензоров, ) из соседних нитей.Обычно зигоспоры распознаются как большие, почти сферические, часто темно-коричневые или черные споры с грубыми стенками и двумя соединяющимися гифами, представляющими две спаривающиеся гаметангии (рис. 2С). Иногда зигоспора может быть окружена несколькими пальцеобразными отростками двух гаметангий.

Аскоспоры (рис. 3) образуются внутри сферических или цилиндрических клеток, называемых asci , чаще всего группами по четыре или восемь (рис. 3А). Обычно аски образуются внутри какой-то ограждающей структуры и поэтому не обнаруживаются обнаженными на гифах.В некоторых случаях аски могут переноситься между гифами и напоминать оогонии с яйцами, но они никогда не будут проникнуты какими-либо оплодотворяющими гифами. Оплодотворение происходит на ранних этапах жизненного цикла и не проявляется во время образования аскоспор.

Базидиоспоры (рис. 4) всегда образуются извне на структуре, называемой базидиумом . Базидии бывают разных форм, но те, что обычно встречаются на плесени, будут иметь форму булавы и нести четыре или восемь спор на острых выступах на вершине.Сначала может быть трудно отличить базидиоспоры от одного из типов спор, инициированных бесполым путем, но всегда следует подозревать присутствие базидий, когда споры, образующиеся извне, постоянно встречаются в группах по четыре или восемь (рис. 4). Как и аскоспоры, базидиоспоры являются результатом раннего оплодотворения, которое нелегко наблюдать.

Бесполые споры обычно встречаются либо в спорангиях, либо в виде конидий. Спорангии представляют собой модифицированные гифы или клетки, содержащие многочисленные споры ( спорангиоспор ).У них никогда не бывает более одной соединительной гифы, и споры не всегда встречаются группами по четыре или восемь человек, как аскоспоры.

Конидии представляют собой группу, которую труднее всего охарактеризовать из-за их большого разнообразия форм. Единственная общая черта, которую имеет большинство конидий, — это то, что они возникают снаружи на клетках, которые их производят. Эти клетки, несущие конидии ( конидиогенных ), могут находиться в довольно специализированных или характерных структурах, которые напоминают те, которые часто несут аски, однако часто необходимо их вскрыть, чтобы подтвердить, что споры действительно являются конидиями, а не аскоспорами.Конидии на гифах, не имеющие сложной структуры плодоношения, являются наиболее часто встречающимся типом. Структуры, которые полностью окружают клетки, несущие конидии, называются pycnidia , а те, которые возникают в результате слияния клеток, несущих конидии, называются synnemata , если они длиннее, чем они широкие, или sporodochia , если они шире, чем длинные.

Главная страница >> Формы и их характеристики >> Как классифицируются формы >> Где найти формы >> Как изолировать плесень >> Как выращивают плесень >> Загрязнение >> Формы под микроскопом >> Как идентифицируются плесени >> Указатель описаний >> Библиография

Масштабное разделение старых и молодых клеток.(A) Большинство гиф …

Контекст 1

Контекст 2

Контекст 3

Контекст 4

Контекст 5

Context 6

Контекст 7

Контекст 8

Контекст 9