Диагностика и лечение внематочной беременности

Диагностика и лечение внематочной беременности продолжает оставаться важной проблемой гинекологии. На сегодняшний день в лечении внематочной беременности методом выбора стали лапароскопические операции. В настоящее время существует несколько методов лечения внематочной беременности: медикаментозный, хирургический и их комбинация.

 

Гинекологическая клиника | Стационар | Гинекологические операции | Гинекология, цены | Запись на прием к гинекологу

 

Методы лечения внематочной беременности

Медикаментозное лечение внематочной беременности с помощью препаратов метотрексата и мифепристона может использоваться в малых сроках, при прогрессирующей беременности и дает пациенткам возможность избежать операции или снизить операционную травму маточной трубы. Однако данные консервативные методики имеют свои ограничения и нежелательные последствия, в связи с чем не нашли широкого применения в практической гинекологии.

Основной метод лечения внематочной беременности в «Клинической больнице» г. Екатеринбурга — хирургический. «Золотым» стандартом в диагностике и лечении внематочной беременности является видеолапароскопия. Более 90% операций выполняется лапароскопическим доступом. Большинство больных с геморрагическим шоком еще недавно оперировались путем лапаротомии. Однако все более расширяющееся и совершенствующееся использование лапароскопии в гинекологической хирургии и формирование когорты гинекологов, в совершенстве владеющих этим доступом меняет существующее положение. Преимущества лапароскопии очевидны — возможность значительно быстрее остановить кровотечение и меньшая травма, не усугубляющая и без того тяжелое состояние больной.

Однако, вид доступа и объем оперативного вмешательства всегда определяются индивидуально. Удаление маточной трубы (сальпингэктомию) проводят при выраженных ее изменениях при размерах плодного яйца более 5 см, при выраженном спаечном процессе 3-4 степени, при наличии эктопической беременности или реконструктивно-пластических операций на трубах в анамнезе, при разрыве трубы с продолжающимся кровотечением.

Проведение успешной операции

Органосохраняющие операции возможны при прогрессирующей или неразвивающейся трубной беременности, размерах плодного яйца не более 4 см, обязательном проведении мониторинга концентрации ХГЧ в крови после операции. При локализации плодного яйца в фимбриальном отделе маточной трубы производят его выдавливание (milking). При локализации плодного яйца в ампулярном отделе трубы производят продольную туботомию (рассечение стенки маточной трубы с удалением плодного яйца и сохранением трубы). Другие виды эктопической беременности (яичниковую, в рудиментарном роге матки, в интерстициальном отделе трубы) также можно оперировать лапароскопическим доступом. Эти операции требуют высокой квалификации эндоскопического хирурга. После лечения внематочной беременности по данным литературы до 50% последующих беременностей маточной локализации, 20% — эктопические беременности и 30% случаев заканчивается последующим бесплодием.

Примеры клинических случаев

Первая пациентка 32 лет, имеющая в анамнезе 1 трубную беременность с удалением маточной трубы в настоящее время вынашивает второго ребенка.

У пациентки 39 лет во время неотложной операции по удалению прервавшейся трубной беременности с внутрибрюшным кровотечением отмечено некоторое увеличение матки. При УЗИ-контроле в послеоперационном периоде диагностирована маточная беременность 6-7 нед. (трубная беременность подтверждена гистологически., чаще сочетание маточной и трубной беременности до недавнего времени встречались после ЭКО).

Третья пациентка 28 лет, имевшая в анамнезе 1 самостоятельные роды с последующей длительной гормональной контрацепцией до 2011г прооперирована в мае 2013г по поводу прогрессирующей трубной беременности — во время операции удалось сохранить трубу, разделить имеющиеся спайки и удалить узел миомы на ножке. Пациентка выписана в удовлетворительном состоянии с низкими цифрами ХГЧ.

Таким образом, преимущества лапароскопического доступа очевидны. Это хороший косметический эффект с отсутствием грубых видимых рубцов на животе, значительно меньшая операционная травма, а значит менее выраженный болевой синдром, меньшая длительность пребывания в стационаре (возможна выписка на 1-3 сутки), более короткая реабилитация. Значительно реже встречаются такие отдаленные последствия как грыжи и спаечный процесс.

Дополнительно для профилактики спаечного процесса используются рекомендуемые в современной хирургии антиспаечные барьеры.

Эндоскопические технологии продолжают совершенствоваться. Эндоскопическая хирургия ищет пути еще большей минимизации операционной травмы. Если стандартная лапароскопия выполняется из 3-4 проколов инструментами с троакарами 12-5 мм, то на сегодня появилось понятие минилапароскопии, когда используются инструменты всего 3-5 мм диаметром, часто даже не требующие дополнительного ушивания.

Однопортовая лапароскопия

Сегодня развивается еще одно направление миниинвазивной хирургии — однопортовая лапароскопия, предусматривающая только один небольшой разрез для введения инструментов. Несмотря на микроразрезы при лапароскопии имеется значительно более лучший обзор операционного поля, чем при открытой хирургии, изображение с помощью камер выводится на большие мониторы.  Сегодня в нашей клинике используется современная видеолапароскопическая аппаратура «Karl Storz», «Olympus» с оптикой HD-качества для лучшей визуализации операционного поля с высоким разрешением.

Несмотря на столь прогрессивное развитие оперативных технологий хотелось бы напомнить о профилактике внематочной беременности. Это, во-первых, адекватная контрацепция (в первую очередь гормональная), препятствующая беременности любой локализации, а также исключающая вероятность аборта с его негативным влиянием на репродуктивную систему и наличием осложнений. Во-вторых профилактика, своевременное выявление и адекватное лечение воспалительных заболеваний половых органов.

Питание во время беременности — гинеколог, маммолог, балашиха, детский, эндокринолог, дерматолог, стоматолог

Правильное питание при беременности наиболее актуально, так как именно от того, что ест женщина во многом зависит развитие плода. Например, от того, достаточно ли беременная получает белка, зависит, будет ли хватать ему строительного материала для роста. Белковое питания для беременных – это очень и очень важно.

К тому же, многие продукты оказывают самое пагубное влияние на состояние и развитие ребенка, да и на самочувствие матери. От таких продуктов, естественно, необходимо отказаться. Важная особенность: правильное питание на ранних сроках беременности должно отличаться от рациона питания женщины на последних неделях. Не всем понятно, откуда берутся такие различия, однако разобраться в теме будет довольно просто. Ведь именно на ранних сроках закладываются важные системы организма, однако размер плода увеличивается незначительно. Поэтому на ранних сроках здоровое питание беременных женщин основывается на достаточном получении минералов, витаминов и т.д.

Во втором триместре беременности питание должно быть перенацелено на повышенное употребление белка, так как именно сейчас продолжает активный рост плода, его основных органов. Для всего этого необходим строительный материал, то есть, белок. Питание же в третьем (последнем) триместре беременности – это, прежде всего, витамины и минералы, необходимые для развития внутренних систем организма ребенка, в особенности кальций для роста костей и развития нервной системы.

При планировании беременности правильное питание также очень важно. Чем более здоровым, сильным и устойчивым будет организм женщины в момент зачатия, тем больше шансов на успешное закрепление плодного яйца в матке. Определенный набор витаминов в организме также способствует правильному развитию эмбриона.

Так вот. Различие рекомендаций по правильному питанию беременных по месяцам вполне оправдано. Но еще нужно учитывать, естественно, и общие правила правильного питания в это замечательное время, вот о них и пойдет речь дальше.

Прежде всего, стоит запомнить одну простую вещь: из-за стола лучше встать немного голодной, чем с тяжестью в желудке. В связи с этим лучше и вовсе придерживаться принципов дробного питания: есть меньше, но чаще. Идеальным вариантом будет есть 4-5 раз в сутки. Кушать последний раз нужно за 3 часа до сна. Поздний ужин крайне нежелателен, можно выпить стакан молока или кефира, съесть яблоко. Такой режим питания для беременных будет оптимальным.

Размер плодного яйца — Вопрос гинекологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 71 направлению: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 97.48% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

Перинатальные изменения размера магистральных артерий плода

Korean Circ J. 2009 Oct; 39 (10): 414–417.

, MD, ¹ , MD, ¹ , MD, ¹ and, MD ²

Хэ Сун Ким

¹ Кафедра педиатрии, Медицинская школа Университета Ихва, Сеул, Корея .

Янг Ми Хонг

¹ Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Ихва, Сеул, Корея.

Седжунг Сон

¹ Кафедра педиатрии, Медицинский факультет женского университета Ихва, Сеул, Корея.

Jung Yun Choi

² Кафедра педиатрии, Медицинский колледж Сеульского национального университета, Сеул, Корея.

¹ Кафедра педиатрии, Медицинский факультет женского университета Ихва, Сеул, Корея.

² Кафедра педиатрии, Медицинский колледж Сеульского национального университета, Сеул, Корея.

Автор, ответственный за переписку: Хэ Сун Ким, доктор медицины, кафедра педиатрии, Медицинский факультет женского университета Ихва, 911-1 Мок-дон, Янчхон-гу, Сеул 158-710, Корея.Тел .: 82-2-2650-5569, Факс: 82-2-2653-3718, rk.ca.ahwe@kseyh

Получено 5 марта 2009 г .; Пересмотрено 6 мая 2009 г .; Принято 7 мая 2009 г. разрешает неограниченное некоммерческое использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Abstract

Предпосылки и цели

При рождении кровообращение плода должно немедленно адаптироваться к внематочной жизни. Нашей целью было оценить перинатальные изменения размера аорты (АО) и легочной артерии (ЛА), а также изучить факторы, влияющие на эти изменения.

Субъекты и методы

Диаметр аорты и ЛА были измерены с помощью эхокардиографии у 50 здоровых доношенных детей за день до и через 4–5 дней после рождения.

Результаты

По сравнению с пренатальными измерениями Ao увеличилось (с 7.4 ± 0,6 мм до 8,4 ± 0,6 мм, p <0,01), а размер ПА уменьшился (с 9,5 ± 0,8 мм до 8,7 ± 0,8 мм, p <0,01) после рождения. Отношение Ao / PA увеличилось с 0,78 ± 0,07 до рождения до 0,97 ± 0,08 после рождения (p <0,01), но не было существенной разницы в сумме диаметров магистральных артерий между пре- и постнатальными измерениями. Постнатальное увеличение размера аорты отрицательно коррелировало с диаметром пренатальной аорты (r = -0,37, p <0,05), но не было связано с массой тела. Согласно множественному регрессионному анализу, значимыми переменными для прогнозирования перинатальных изменений размера АО и ПА были пренатальное соотношение АО / ПА и диаметр пренатального ПА, соответственно.

Заключение

Несмотря на существующую разницу в диаметрах пренатального диаметра между АО и ПА, изменения кровообращения при рождении делают большие артерии одинаковыми, причем независимо от массы тела.

Ключевые слова: Аорта, легочная артерия, плод, эхокардиография

Введение

Циркуляция плода уникальна тем, что два желудочка функционируют параллельно. В момент рождения кровообращение плода должно немедленно адаптироваться к внематочной жизни. Физиологические изменения кровообращения при рождении влияют на размер желудочков, и малое кровообращение отделено от системного кровообращения с резким увеличением кровотока. ¹⁾

Предыдущие исследования измерения сердца плода человека с помощью ультразвуковых методов предоставили количественные данные для оценки сердечного роста плода. ^{2) , 3)} Sahn et al. ³⁾ также сообщили о своих результатах измерения желудочков и магистральных сосудов плода, отложив их измерения в зависимости от веса плода; однако их исследование имело ограниченное разрешение с использованием низкочастотных преобразователей, и серийные измерения не были получены для некоторых из исследуемых групп.

В клинической практике мы часто сталкивались с тем, что маленькая аорта, диагностированная пренатально с помощью эхокардиографии плода у доношенного ребенка, после рождения становится аортой почти нормального размера. Таким образом, мы предприняли это исследование: 1) для оценки изменений кровообращения в перинатальном периоде путем измерения размера аортальных и легочных артерий до и после рождения и 2) для изучения факторов, влияющих на такие перинатальные изменения.

Субъекты и методы

В исследование были включены 50 доношенных (от 37 до 40 недель гестации) беременных, которым планировалось сделать кесарево сечение (К / С).Все матери были здоровы, и ни у одной из них не было проблем со здоровьем. Ни у одного из них не было показаний к эхокардиографии плода, но они согласились участвовать в этом исследовании и были получены информированные письменные согласия. С помощью ультразвуковой системы Acuson 128XP (Маунтин-Вью, Калифорния, США) с датчиком 5 МГц была проведена эхокардиография 50 нормальным детям за день до рождения и снова через 4–5 дней после родов (все одним исследователем, HSK). У новорожденных не было структурных аномалий, в том числе врожденных пороков сердца.С использованием методов кинопетли и масштабирования, внутренние диаметры Ao и PA были измерены во время диастолы, когда полулунные клапаны были закрыты. Диаметр аорты измеряли на уровне фиброзного кольца в продольной оси; диаметр PA был измерен на 1 мм выше синотубулярного соединения PA в виде короткой оси. Измерения проводились только тогда, когда качество изображения позволяло четко определить каждую структуру с углом освещения около 90 °. Рассчитывали отношение диаметра аорты к диаметру PA (Ao / PA) и разницу между пренатальным и постнатальным диаметрами.После рождения также регистрировались физические параметры, включая массу тела, окружность головы и окружность груди. Чтобы определить вариабельность внутри наблюдателя, диаметры АО и PA у 10 случайно выбранных новорожденных были измерены одним наблюдателем (HSK) в двух разных случаях. На предмет вариабельности между наблюдателями их исследовали два наблюдателя (HSK, SS), которые не знали о результатах друг друга.

Статистический анализ был выполнен с помощью пакета статистических данных для социальных наук (SPSS) 11.5 (SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс, США). Различия в пренатальных и послеродовых измерениях сравнивали с помощью парного t-критерия. Для определения взаимосвязи между большим размером артерии и физическими параметрами использовался линейный регрессионный анализ. Факторы, влияющие на перинатальные изменения размеров магистральных артерий, были исследованы с помощью множественного регрессионного анализа. Вариабельность рассчитывалась как разница от среднего значения двух измерений и выражалась в процентах от среднего. Достоверным считали р <0,05.

Результаты

Пренатально диаметр Ao и PA составлял 7,4 ± 0,6 мм и 9,5 ± 0,8 мм соответственно. Постнатально диаметр аорты увеличился до 8,4 ± 0,6 мм, а диаметр ЛА уменьшился до 8,7 ± 0,8 мм (p <0,01) (). Соотношение АО / ПА увеличилось с 0,78 ± 0,07 до рождения до 0,97 ± 0,08 после рождения (р <0,01) (). Однако не было значимой разницы в сумме диаметров АО и ПА до и после рождения (16,9 ± 1,2 мм против 17,1 ± 1,3 мм, p = 0,36) ().

Постнатально диаметр аорты (Ao) увеличивается, а диаметр легочной артерии (PA) уменьшается по сравнению с измерениями до рождения.

Отношение диаметров АО / ПА увеличивается с 0,78 ± 0,07 до рождения до 0,97 ± 0,08 после рождения (р <0,01), но нет значимой разницы в сумме диаметров АО и ПА до и после рождения. Ао: аорта, ПА: легочная артерия.

Диаметр пренатальной аорты положительно коррелировал с массой тела (r = 0,39, p <0,05), окружностью головы (r = 0,28, p <0,05) и окружностью груди (r = 0,43, p <0,05), но диаметр пренатальной PA не коррелировали с этими переменными (не показаны).Постнатальное увеличение размера аорты отрицательно коррелировало с диаметром пренатальной аорты (r = -0,37, p <0,05) (), но это изменение не коррелировало с массой тела (). Напротив, послеродовое уменьшение размера PA коррелировало с диаметром внутриутробного PA (r = 0,40, p <0,05) () и массой тела (r = -0,42, p% 0,05) (). Множественный регрессионный анализ показал, что значимыми предикторами перинатальных изменений размера большой артерии были пренатальное соотношение АО / ПА (p = 0,002) для увеличения размера аорты и диаметр пренатальной ПА (p = 0. 01) для уменьшения размера ПА.

Постнатальное увеличение диаметра аорты (Ao) связано с диаметром пренатальной аорты (A) и не связано с массой тела (B).

Постнатальное уменьшение диаметра легочной артерии (ЛА) положительно коррелирует с диаметром пренатальной ЛА (А) и отрицательно — с массой тела (В).

Послеродовой диаметр аорты коррелировал с диаметром пренатальной ПА (r = 0,56, p <0,05), диаметром пренатальной аорты (r = 0,67, p <0,05) и суммой диаметров пренатальной Ао и пренатальной ПА (r = 0.71, р <0,05) ().

Постнатальный диаметр аорты (Ao) коррелирует с суммой диаметров пренатальной Ao и легочной артерии (PA).

Изменчивость внутри наблюдателя и изменчивость между наблюдателями для АО составляла 2,7 ± 2,1% и 2,9 ± 2,1%, соответственно; для ПА они составили 3,1 ± 2,2% и 5,3 ± 2,6% соответственно. Изменчивость внутри наблюдателя была меньше вариабельности между наблюдателями.

Обсуждение

Сообщалось о нескольких исследованиях развития магистральных артерий плода, ^{4) , 5)} , но исследований, посвященных перинатальным изменениям размеров магистральных артерий плода, мало. Чтобы задокументировать перинатальные изменения, Sahn et al. ³⁾ продольно обследовали 19 плодов после 20 недель беременности. Напротив, мы обследовали доношенных детей на сроках от 37 до 40 недель гестации, и пренатальные измерения были выполнены за день до запланированных родов (путем кесарева сечения). Таким образом, наши данные могут предоставить более точные наблюдения за изменениями кровообращения, которые обычно происходят при рождении.

У плода размер магистральных артерий увеличивается с возрастом гестации или весом плода, а АО немного меньше, чем ПА. ^{3 — 5)} В исследованиях Shapiro et al. ⁴⁾ и Sharland and Allan, ⁵⁾ соотношение АО / ПА на 14-40 неделях гестации составляло около 0,9 с небольшим снижением во время беременности, в то время как в нашем исследовании это соотношение на 37-40 неделях гестации составляло 0,78. и увеличился до 0,97 после рождения. Наши данные показывают, что сумма диаметров магистральных артерий остается постоянной (), хотя АО становится больше, а ПА — меньше. Это приводит к выравниванию размеров АО и ПА после рождения, как и при послеродовых изменениях размера желудочков. ^{6 — 8)} Эти данные подтверждают идею о том, что эти две кровеносные системы разделяются при рождении и обрабатывают одинаковое количество крови после рождения.

Интересно, что только диаметр пренатальной аорты, а не диаметр ПА был связан с физическими параметрами. Следовательно, следует учитывать не только гестационный возраст, но также массу тела или другие параметры тела, когда аорта диагностируется как «малая» с помощью эхокардиографии плода. Кроме того, послеродовое увеличение размера аорты в значительной степени зависело от пренатального соотношения АО / ПА и не было связано с массой тела (), предполагая, что, хотя существует более значительная разница в пренатальном размере между АО и ПА у меньшего ребенка, Ao меньшего размера может стать больше после рождения по сравнению с размером пренатальной аорты, даже у ребенка с низкой массой тела при рождении, как показано на рис. Напротив, послеродовое уменьшение размера ПА было отрицательно связано с массой тела (). Наши данные показывают, что сумма диаметров магистральных артерий остается постоянной. Таким образом, отрицательная корреляция между уменьшением размера PA и массой тела может указывать на то, что у меньшего ребенка размер PA уменьшается в большей степени, чем у более крупных детей, когда у них наблюдается большее послеродовое увеличение размера аорты, как упоминалось выше. Чтобы подтвердить эти результаты, необходимы дальнейшие клинические исследования, изучающие различия в постнатальных изменениях магистральных артерий в зависимости от массы тела.

Постнатальный диаметр аорты имел устойчивую положительную корреляцию с пренатальными диаметрами АО и ПА и более сильную связь с суммой пренатальных диаметров АО и ПА ().

Важно установить вариабельность внутри наблюдателя и между наблюдателями, чтобы определить, вызваны ли изменения размера большой артерии при рождении просто вариабельностью в измерениях или истинными изменениями. Средняя вариабельность диаметра аорты внутри и между наблюдателями варьировала от 2 до 5%, что является приемлемым уровнем.Практически мы определяли только вариабельность послеродового диаметра АО и ПА и не определяли вариабельность пренатальных диаметров АО и ПА.

У нашего исследования есть некоторые ограничения. Во-первых, из-за узкого диапазона гестационного возраста и размеров тела в исследуемой популяции наше исследование показало небольшие коэффициенты корреляции между каждой переменной. Во-вторых, между исследованиями могут существовать значительные различия в методах измерения. Мы измерили внутренний диаметр магистральных артерий без учета толщины эхо-линий.Наконец, нельзя исключить влияние самого кесарева сечения как фактора, способствующего физиологическим изменениям при рождении.

Несмотря на эти ограничения, мы пришли к выводу, что при пренатальной оценке размера аорты следует учитывать массу тела плода. Хотя пренатально существует большая разница между АО и ПА у младенцев с меньшей массой тела, изменения кровообращения при рождении делают размер обеих артерий одинаковым независимо от массы тела.

Ссылки

1. Hong JS, Choi JY, Zhu L, et al.Эхокардиографическая оценка диастолической функции левого желудочка в переходный период кровообращения. Korean Circ J. 2006; 36: 652–660. [Google Scholar] 2. Ахирон Р., Голан-Порат Н., Габбай Ю. и др. Внутриутробные ультразвуковые измерения диаметра аорты и легочной артерии плода в течение первой половины беременности. Ультразвуковой акушерский гинекол. 1998. 11: 180–184. [PubMed] [Google Scholar] 3. Sahn DJ, Lange LW, Allen HD и др. Количественная корсс-секционная эхокардиография в реальном времени у здорового плода и новорожденного человека.Тираж. 1980; 62: 588–597. [PubMed] [Google Scholar] 4. Шапиро И., Дегани С., Лейбовиц З., Охель Г., Таль Ю., Абинадер Э.Г. Измерения сердечной деятельности плода, полученные с помощью трансвагинальной и трансабдоминальной поперечной эхокардиографии от 14 недель беременности до срока. Ультразвуковой акушерский гинекол. 1998. 12: 404–418. [PubMed] [Google Scholar] 5. Шарланд Г.К., Аллан Л.Д. Нормальные показатели сердечной деятельности плода, полученные с помощью поперечной эхокардиографии. Ультразвуковой акушерский гинекол. 1992; 2: 175–181. [PubMed] [Google Scholar] 6.Тан Дж, Сильверман Н.Х., Хоффман Дж., Виллегас М., Шмидт К.Г. Размеры сердца определяются с помощью поперечной эхокардиографии у нормального плода человека от 18 недель до срока. Am J Cardiol. 1992; 70: 1459–1467. [PubMed] [Google Scholar] 7. Винсберг Ф. Эхокардиография сердца плода и новорожденного. Invest Radiol. 1972; 7: 152–158. [PubMed] [Google Scholar] 8. Владимирофф JW, Vosters R, McGhie JS. Нормальная геометрия и функция желудочков сердца в последнем триместре беременности и в раннем неонатальном периоде.Br J Obstet Gynaecol. 1982; 89: 839–844. [PubMed] [Google Scholar]

Первые международные стандарты оценки роста плода и размера новорожденных при рождении — Целевая группа по материнскому здоровью

Размещено 5 сентября 2014 г. 2 ноября 2016 г.

Автор: Кэти Миллар, технический писатель, Инициатива «Женщины и здоровье», Гарвардский университет им. Chan School of Public Health

Впервые в мире установлены международные стандарты как для роста плода, так и для размера новорожденного.Эти стандарты были разработаны глобальной командой под руководством ученых из Оксфордского университета.

Международные стандарты — один для растущего плода и другой для новорожденных — опубликованы сегодня в двух статьях в журнале The Lancet . Они были разработаны в рамках масштабного проекта INTERGROWTH-21 ^st , финансируемого Фондом Билла и Мелинды Гейтс, на завершение которого за шесть лет ушло более 300 врачей и исследователей из 27 учреждений по всему миру. Для разработки стандартов было набрано почти 60 000 беременных женщин в восьми четко определенных городских районах Бразилии, Китая, Индии, Италии, Кении, Омана, Великобритании и США.Из этих женщин было изучено более 4600 здоровых, хорошо питающихся женщин с беспроблемной беременностью.

В предыдущей статье эти исследователи заявили, что рост определяется не расой или этнической принадлежностью, а состоянием здоровья матери. Рост может быть стандартом во всем мире, и теперь у нас есть способ его измерить.

Выявление недоедающих новорожденных

Эти стандарты предоставляют кривые роста плода (измеренные с помощью ультразвука) и размеров новорожденного при рождении, включая вес, длину и окружность головы, в соответствии с гестационным возрастом.Это прорыв. В настоящее время во всем мире используется более 100 различных графиков роста для оценки роста плода и размера новорожденного. Однако они только описывают, как новорожденные растут в определенной популяции или регионе, и создают проблемы как для выявления, так и для лечения недоедающих новорожденных. Теперь, благодаря этим новым стандартам, врачи всего мира смогут выявлять новорожденных с недостаточным и избыточным весом в раннем возрасте.

Почему международные стандарты важны

Почему так важно точно измерять рост? По состоянию на 2010 год 27% рождений во всем мире, или 32.4 миллиона младенцев в год в странах с низким и средним уровнем дохода рождаются уже недоедающими. Плохой рост, наблюдаемый у маленьких для гестационного возраста детей, имеет большое значение для начала жизни младенца, подвергая их повышенному риску заболевания и смерти по сравнению с детьми, получившими хорошее питание при рождении. Маленький размер при рождении также увеличивает риск диабета, высокого кровяного давления и сердечно-сосудистых заболеваний во взрослом возрасте. Кроме того, уход за недоедающими новорожденными ложится невероятным бременем и экономическим бременем на системы здравоохранения и общество.

Но с этими новыми стандартами по меньшей мере 13 миллионов новых новорожденных, которые теперь считаются «нормальными» на основании местных карт, будут ежегодно определяться как недоедающие с использованием их международных стандартов во всем мире.

«Возможность идентифицировать миллионы дополнительных недоедающих младенцев при рождении дает им возможность получать нутритивную поддержку и целевое лечение, без которого около 5% могут умереть в первый год жизни или разовьются серьезные, долгосрочные проблемы со здоровьем, — говорит ведущий автор, профессор Хосе Вильяр из Оксфордского университета. «Огромное улучшение здравоохранения, которого мы можем достичь, беспрецедентно».

Рождение с избыточным весом также представляет собой усугубляющуюся проблему, особенно в развитых и развивающихся странах, в результате роста показателей материнского ожирения из-за избыточного питания. Младенцы с избыточным весом подвергаются повышенному риску развития диабета и высокого кровяного давления в более позднем возрасте.

Снижение смертности и заболеваемости во всем мире

«Эти новые стандарты роста плода и размера новорожденного… являются лучшим способом сравнения популяций по всему миру.Мы надеемся, что их широкое использование будет способствовать улучшению исходов родов и снижению перинатальной смертности и заболеваемости во всем мире. В сочетании с существующими стандартами роста детей ВОЗ можно будет делать выводы о росте и размере от ранней беременности до пятилетнего возраста в глобальном масштабе », — сказал профессор Зульфикар Бхутта из Университета Ага Хана в Карачи, Пакистан, и больницы. для больных детей в Торонто, председатель Руководящего комитета проекта INTERGROWTH-21

st .

Следуя тому же подходу, что и в Многоцентровом справочнике ВОЗ по росту, новые стандарты для плода и новорожденного предоставят практикующим врачам во всем мире клинические инструменты для мониторинга роста от ранней беременности до школы.

Следующие шаги

Теперь, когда у нас есть эти стандарты, ключевым моментом является расширение масштабов. Профессор Стивен Кеннеди из Оксфордского университета, один из ведущих авторов исследования, сказал: «Мы разработали первые международные стандарты, описывающие, как младенцы в утробе матери должны расти, если им обеспечены хорошее здоровье и питание, и они живут в здоровая окружающая среда. Теперь нам необходимо работать с политиками и клиницистами на региональном, национальном и международном уровнях, чтобы внедрить новые инструменты на практике во всем мире.”

Чтобы получить доступ к полному пакету последних публикаций и инструментов, перейдите по ссылкам ниже:

1. Международные стандарты роста плода на основе серийных ультразвуковых измерений: продольный рост плода
2. Международные стандарты веса, длины и окружности головы новорожденных в разбивке по гестационному возрасту и полу: новорожденные
3. Сходство роста плода и размера новорожденного в неизолированных популяциях в проекте INTERGROWTH-21st: продольное исследование роста плода и перекрестное исследование новорожденных
4. Международные стандарты раннего определения размера плода и определения срока беременности, основанные на ультразвуковом измерении длины темени и крестца в первом триместре

Что это такое, причины и перспективы

Обзор

Что такое макросомия плода?

Макросомия плода — это состояние, при котором плод крупнее среднего — вес при рождении составляет от 4000 граммов (8 фунтов 13 унций) до 4500 граммов (9 фунтов 15 унций).Макросомия плода может вызвать осложнения как для ребенка, так и для матери во время родов. Эти риски могут быть дополнительно увеличены, когда вес плода превышает 4500 граммов.

Что такое дистоция плеча?

Одним из осложнений макросомии плода является дистоция плеча, которая возникает, когда голова ребенка выходит из матки, но плечи застревают внутри тела матери, что требует дополнительных маневров для безопасных родов. Это серьезная ситуация, которая чаще встречается у крупных детей.

У ребенка дистоция плеча может вызвать перелом ключицы (ключицы) или плечевой кости (кость в плече) или травму плечевого сплетения (повреждение нервов, которые посылают сигналы в руки). В редких случаях это может вызвать повреждение мозга или смерть.

Для матери дистоция плеча может вызвать сильное кровотечение, разрыв матки или повреждение влагалища, которое требует наложения швов.

Когда возникает дистоция плеча, существует несколько вариантов безопасных родов:

• Врач может манипулировать ребенком, чтобы изменить его положение.
• Мать может изменить положение, перевернувшись или подняв ноги к животу.
• Ребенка можно родить путем кесарева сечения (хирургическим путем удаляется из живота матери).

Однако исследования показали, что значение кесарева сечения при макросомии плода ограничено, отчасти потому, что размер ребенка трудно предсказать. Кроме того, некоторые травмы нервов, похожие на травмы, вызванные дистоцией плеча, могут произойти в утробе матери до родов.

Симптомы и причины

Что вызывает макросомию плода?

Чем дольше беременность длится дольше положенного срока (особенно, если срок беременности превышает 40 недель), тем выше риск макросомии плода, потому что ребенок продолжает расти в утробе матери. Макросомия плода чаще встречается у мальчиков.

Кроме того, макросомия плода может возникнуть, если мать:

• Страдает ожирением или набирает слишком много веса во время беременности.
• Страдает диабетом или непереносимостью глюкозы (организм не может правильно перерабатывать глюкозу).
• Возраст от 35 до 17 лет.
• Уже родила крупного ребенка.

Диагностика и тесты

Как диагностируется макросомия плода?

Во время беременности трудно определить, какого размера будет ребенок, когда он родится. Врачи используют ультразвуковые тесты, чтобы узнать все, что можно о плоде, в том числе его размер. Ультразвук — это диагностическая процедура, которая передает высокочастотные звуковые волны через ткани тела. Отголоски записываются и преобразуются в видео или фотоизображения внутренних структур тела.

Для диагностики макросомии плода врач будет искать:

• Высота дна матки (расстояние от верхушки матки до лобковой кости)
• Количество околоплодных вод, которое окружает ребенка внутри матки. Если имеется аномально большое количество околоплодных вод (многоводие), ребенок может быть крупнее среднего
• Расчетный вес ребенка на основании ультразвуковых расчетов

Врач также может спросить рожавшую мать (женщину, которая раньше рожала), сколько, по ее мнению, весит ребенок.

Профилактика

Можно ли предотвратить макросомию плода?

Макросомия плода непредсказуема. Диагноз ставится только после взвешивания ребенка после родов. Младенцы могут родиться крупнее среднего с любым из известных факторов риска или без него.

Укрепление здоровья и здоровая беременность могут улучшить шансы:

• Обратитесь к врачу для регулярного дородового ухода. Частые посещения позволяют вам и вашему врачу внимательно следить за развитием вашего ребенка, а также дают вам возможность задать вопросы.Ваш врач составит для вас график.
• Следите за своим весом. Ваш вес до беременности имеет значение, как и то, какой вес вы прибавили во время беременности.
• Если у вас диабет, примите соответствующие меры для его лечения. Факторами риска макросомии плода являются диабет до беременности и диабет во время беременности (гестационный диабет). Гестационный диабет обычно проходит после рождения ребенка, но у женщин, у которых он был, выше риск диабета в более позднем возрасте.

Перспективы / Прогноз

Какие проблемы может вызвать макросомия плода после родов?

Исследования показывают, что у крупных детей повышен риск низкого уровня сахара в крови (гипогликемии), ожирения в детстве и развития метаболического синдрома (совокупность состояний, повышающих вероятность сердечных заболеваний, инсульта и диабета). Большинство младенцев, которые страдают переломами или повреждением нервов во время родов, полностью выздоравливают от этих травм.

Какой стандарт размера плода следует использовать для диагностики плода с малым или большим размером для гестационного возраста?

Международные эксперты обсуждают достоинства имеющихся стандартов для оценки роста плода и веса при рождении, а также других мер для достижения наилучших результатов родов в приложении к Американскому журналу акушерства и гинекологии

В этом специальном дополнении к Американский журнал акушерства и гинекологии (AJOG) ведущие эксперты описывают шесть действующих стандартов роста плода и обсуждают их сильные стороны и недостатки.

Этот рисунок иллюстрирует шесть различных вариантов выбора стандартов размера плода, представленных в этом приложении, и представляет предположения, сделанные исследователями при разработке стандартов размеров.

По оценкам, не менее 13 миллионов новорожденных малы для гестационного возраста (SGA) в странах с низким и средним уровнем доходов. Ускорение роста плода может привести к рождению крупного для гестационного возраста (LGA) новорожденного. Стандарты оценки роста плода и веса при рождении имеют важное значение для оказания качественной клинической помощи и стали еще более важными, поскольку появляется все больше доказательств того, что проблемы, связанные с ростом, потенциально можно избежать и могут иметь долгосрочные последствия.В связи с распространением стандартов размеров плода практикующие акушеры сталкиваются с различными рекомендациями по диагностике плода с SGA или LGA.

«Плод с SGA подвержен большему риску внутриутробной и перинатальной смерти, дистресса плода, требующего кесарева сечения, а также краткосрочных и долгосрочных осложнений. Например, недавнее исследование показывает, что 15 процентов детей, родившихся в срок до срока SGA, испытывают трудности с подъемом по лестнице и составлением предложений из более чем двух слов в возрасте двух лет », — комментирует Роберто Ромеро, доктор медицинских наук, доктор медицинских наук, доктор медицинских наук, начальник отдела Отделение перинатологических исследований NICHD / NIH, Bethesda, MD.«Младенцы, родившиеся с SGA, подвергаются большему риску развития таких заболеваний у взрослых, как диабет, гипертония и сердечно-сосудистые заболевания в виде сердечного приступа, инсульта и т. Д. Младенцы с LGA также подвержены риску осложнений».

Практический вопрос заключается в том, какой стандарт лучше всего подходит для обнаружения плодов SGA. Некоторые из них были предложены и описаны на прилагаемом рисунке. Плюсы и минусы каждого стандарта являются основным предметом этого специального дополнения.

Международный консорциум по развитию плода и новорожденного в 21 веке (INTERGROWTH-21st)
Хосе Виллар, доктор медицины, профессор перинатальной медицины Оксфордского университета, и его коллеги, представляющие консорциум INTERGROWTH-21st, объясняют, что его целью было развитие международные предписывающие стандарты для оценки роста плода с помощью УЗИ и высоты дна матки, преждевременного послеродового роста, размера и строения тела новорожденного, прибавки в весе матери и развития ребенка в возрасте двух лет.Финансируемый Фондом Билла и Мелиссы Гейтс, это первый всеобъемлющий набор международных стандартов оптимального роста плода и новорожденного, который полностью соответствует существующим стандартам роста детей Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).

Стандарт был разработан на основе данных, собранных в международной когорте здоровых, хорошо питающихся женщин из восьми городских районов Бразилии, Италии, Омана, Великобритании, США, Китая, Индии и Кении, которые подвергались низкому риску неблагоприятных материнских заболеваний. и перинатальные исходы.Он пришел к выводу, что при отсутствии материнских ограничений плоды растут с одинаковой скоростью и что плоды всех этнических групп растут с одинаковой скоростью. Тема темпов роста среди этнических групп обсуждалась в этой области.

Индивидуальный оптимальный вес, связанный с беременностью (РОСТ)
Джейсон Гардози, доктор медицинских наук, и его коллеги из Перинатального института, Бирмингем, Соединенное Королевство, которые разработали стандарт РОСТА (индивидуализированный оптимальный вес, связанный с беременностью), сравнивают РОСТ и МЕЖДУНАРОДНЫЙ РОСТ 21-й стандарт.Стандарт GROW предполагает, что вес, рост, этническая принадлежность и родство матери, а также пол плода пропорционально влияют на расчетный вес плода.

Команда из Бирмингема проанализировала данные о материнстве, регулярно собираемые в десяти странах, где в их основных этнических группах было в общей сложности 1,25 миллиона доношенных беременностей. Каждый из стандартов GROW и INTERGROWTH-21st был применен к данным для определения показателей SGA и LGA, с соответствующим относительным риском и популяционным риском мертворождения.Они обнаружили, что индивидуальная оценка привела к увеличению выявления SGA и риска мертворождения, в то время как широкий разброс показателей SGA с использованием стандарта INTERGROWTH-21, по-видимому, отражал различия в физиологических характеристиках беременности в десяти популяциях беременных.

«Не было представлено никаких доказательств того, что INTERGROWTH-21st улучшает идентификацию плодов или новорожденных с повышенным риском неблагоприятного исхода», — отмечает профессор Гардини в сопроводительном обзоре, опубликованном в AJOG.«Напротив, есть свидетельства значительных различий между разными группами населения и отдельных лиц, а также все больше свидетельств против универсального подхода. Более логично скорректировать характеристики каждой матери, принимая во внимание ее этническое происхождение, ее рост, вес и половую принадлежность, и установить стандарт роста и веса при рождении для каждой беременности, по которому можно будет оценивать фактический рост. Индивидуальный стандарт лучше отражает неблагоприятный исход беременности на обоих концах диапазона размеров плода и повышает уверенность клиницистов в оценке роста, обеспечивая при этом уверенность, когда аномальные размеры просто представляют собой физиологические отклонения.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ)
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) спонсировала исследование роста плода, которое обсуждают Торвид Кисеруд, доктор медицинских наук, из Университета Бергена, Норвегия, и его коллеги.

Доктор Кисеруд объясняет: «Диаграммы роста плода ВОЗ предназначены для использования в международном масштабе на основе беременностей с низким уровнем риска в популяциях в Африке, Азии, Европе и Южной Америке. Мы считаем целесообразным проверять и контролировать соответствие графиков роста местным потребностям, поскольку уточнения возможны путем изменения пороговых значений или настройки в зависимости от пола плода, материнских факторов и популяций.Выводы этого исследования отличаются от выводов, предложенных INTERGROWTH-21st.

Исследование роста плода, проведенное NICHD
Таблицы размеров плода Национального института здоровья ребенка и человеческого развития им. Юнис Кеннеди Шрайвер (NICHD) были разработаны путем изучения беременных женщин из разных этнических групп, проживающих в США (европеоидные, афро-американские, латиноамериканские , и азиатский). В отличие от индивидуального подхода GROW, авторы не предполагали, что этническая принадлежность не оказывает пропорционального влияния на расчетный вес плода во время беременности, и, следовательно, исследователи составили отдельные диаграммы для каждой этической группы.В исследование была включена популяция женщин с низким уровнем риска, родивших в срок.

В экспертном обзоре NICHD Кэтрин Л. Грантц, докторе медицины, магистратуре, и ее коллегах сравниваются и противопоставляются исследования NICHD, INTERGROWTH-21st и многоцентровое эталонное исследование ВОЗ, и делаются выводы в свете различий в целях и выборке. кадры и аналитические подходы.

«Оценка роста плода с помощью одноразового измерения остается стандартной клинической практикой, несмотря на признание того, что одно измерение может указывать только на размер», — комментирует д-р.Грантц. «В конечном счете, именно знание о росте плода в дополнение к другим факторам и клиническому заключению должно вызывать вмешательство».

Отделение перинатологических исследований (PRB of NICHD) — Детройт, Мичиган, США
Отделение перинатологических исследований NICHD описывает разработку диаграммы размера / роста плода, полученной на основе данных продольной оценки веса плода, полученных от афроамериканских женщин в Детройте и сравнивает это с тремя существующими стандартами. Исследователи отмечают, что пол плода и рост матери имеют пропорциональное влияние во время гестации, в то время как вес и родство матери имеют возрастающее влияние на расчетный вес плода с увеличением срока гестации.Они определяют размер плода для беременности с оптимальными условиями (исключая влияние клинической патологии) аналогично тому, как это описано в индивидуальном подходе GROW. «Этот стандарт классифицирует большее количество плодов как подверженных риску SGA по сравнению с существующими стандартами, особенно среди плодов, родившихся недоношенными, но классифицирует примерно такое же количество LGA», — комментирует д-р Роберто Ромеро, возглавлявший исследование. «Сравнение четырех стандартов роста показало, что наиболее важным фактором, определяющим согласие между стандартами, является то, учитывают ли они те же факторы, которые, как известно, влияют на рост плода.”

Индивидуальная оценка роста (IGA / Baylor / PRB NICHD)

Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что перинатальная заболеваемость связана с аномальной скоростью роста плода по окружности живота как у детей с SGA, так и у LGA, сообщает Russell L. Deter, MD. из Техасской детской больницы и его коллеги. Они описывают концептуальную основу для практического и свободно доступного программного приложения, Индивидуальной программы оценки роста (IGA), которое было разработано для реализации этого подхода в клинических и исследовательских целях.IGA предполагает, что потенциал роста плода может быть выведен из скорости роста, полученной из двух или трех наблюдений во втором триместре. «Индивидуальная оценка роста обеспечивает комплексный метод выявления аномалий роста плода и / или новорожденного в третьем триместре на основе индивидуального потенциала роста», — объясняет доктор Детер. «Клиническое использование индивидуальной оценки роста для характеристики аномального роста и его связи с физиологическими изменениями, перинатальными осложнениями и длительной инвалидностью требует дальнейшего изучения.”

Самым важным вкладом этого метода является то, что он использует скорость роста каждого плода индивидуально в качестве собственного контроля для оценки потенциала роста.

В других статьях этого дополнения также рассматриваются механизмы заболевания, ответственные за ограничение роста плода, оптимальное время родов, а также роль аспирина, гепарина и других вмешательств в профилактике и лечении задержки роста плода.

Доктор Ромеро добавляет, что «это дополнение представляет собой серьезное обязательство AJOG и его издателя, Elsevier, по улучшению здравоохранения беременных женщин, неродившихся детей и их семей, сделав эту коллекцию высококачественных экспертных обзоров и оригинальных исследований в свободном доступе. всем читателям по всему миру.”

—

Примечания для редакторов
Приложение -« Рост плода: оценка и управление »под редакцией Роберто Ромеро, доктора медицинских наук, отделения перинатологических исследований Национального института здоровья ребенка и человеческого развития Юнис Кеннеди Шрайвер / Национальные институты здравоохранения / Департамент здравоохранения и социальных служб, с приглашенными редакторами Джоном Кингдом, доктором медицины, больница Маунт-Синай, Торонто, Рассел Детер, доктор медицины , Медицинский колледж Бейлора, Хьюстон, Уэсли Ли, доктор медицины, Медицинский колледж Бейлора , Хьюстон, и Энтони Винцилеос, доктор медицины, Больница Уинтропа Нью-Йоркского университета, Минеола.Он представлен как том 218, выпуск 2 (приложение) Американского журнала акушерства и гинекологии , опубликованного Elsevier, и находится в свободном доступе по адресу https://www.ajog.org/issue/S0002-9378(17)X0017-3 .

Полный текст всех статей также доступен для аккредитованных журналистов по запросу. Свяжитесь с Эйлин Лихи по телефону +1 732 238 3628 или по адресу [email protected], чтобы получить копии. С доктором Роберто Ромеро можно связаться по телефону +1 313 330 9978 или [email protected].

Об американском журнале акушерства и гинекологии
Американский журнал акушерства и гинекологии , известный как «Серый журнал», охватывает весь спектр области, от новейших диагностических процедур до ведущих краевое исследование.Журнал всесторонне освещает специальность, включая медицину материнства и плода, репродуктивную эндокринологию / бесплодие и гинекологию. Он также публикует документы ежегодных встреч нескольких из восьми спонсирующих его обществ, в том числе Общества материнско-фетальной медицины и Общества гинекологических хирургов. Журнал также был признан одним из 100 самых влиятельных журналов в области биологии и медицины за последние 100 лет, как это определено Отделом биомедицины и биологических наук Ассоциации специальных библиотек (2009).www.AJOG.org

Анализ размера ДНК плода в моче беременных женщин с высоким разрешением путем массового параллельного секвенирования парных концов

Абстрактные

Фон

ДНК плода в материнской моче, если она присутствует, может быть ценным источником генетического материала плода для неинвазивной пренатальной диагностики. Однако существование ДНК плода в материнской моче остается спорным. Проблема связана с отсутствием соответствующей технологии для надежного обнаружения потенциально сильно деградированной ДНК плода в материнской моче.

Методология

Мы использовали массовое параллельное секвенирование парных концов для исследования бесклеточных молекул ДНК в материнской моче. Образцы катетеризованной мочи были собраны у семи беременных женщин в третьем триместре беременности. Мы обнаружили ДНК плода путем идентификации секвенированных считываний, содержащих специфичные для плода аллели однонуклеотидных полиморфизмов. Размеры отдельных фрагментов ДНК в моче определяли по позициям выравнивания парных считываний.Мы измерили фракционную концентрацию ДНК плода, а также распределение по размерам ДНК плода и матери в моче матери.

Основные результаты

Бесклеточная ДНК плода была обнаружена в пяти из семи образцов мочи матери, при этом фракционные концентрации ДНК плода варьировались от 1,92% до 4,73%. После родов ДНК плода не обнаруживалась в материнской моче. Общие бесклеточные молекулы ДНК в моче были менее интактными по сравнению с ДНК плазмы. Фрагменты ДНК плода в моче были очень короткими, а наиболее доминирующие последовательности плода имели длину от 29 до 45 пар оснований.

Выводы

С использованием массового параллельного секвенирования мы подтвердили наличие трансренальной ДНК плода в моче матери и показали, что ДНК плода в моче сильно деградировала.

Образец цитирования: Tsui NBY, Jiang P, Chow KCK, Su X, Leung TY, Sun H, et al. (2012) Анализ с высоким разрешением ДНК плода в моче беременных женщин с помощью массивно-параллельного секвенирования с парными концами. PLoS ONE 7 (10): e48319. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0048319

Редактор: Cees Oudejans, Медицинский центр университета VU, Нидерланды

Поступила: 04.08.2012; Одобрена: 6 сентября 2012 г .; Опубликован: 31 октября 2012 г.

Авторские права: © 2012 Tsui et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Исследование было поддержано Комитетом по университетским грантам правительства Специального административного района Гонконг, Китай, в рамках программы «Области передового опыта» (AoE / M-04/06). YMDL был поддержан председателем от Фонда Ли Ка Шинга. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: KCAC, RWKC и YMDL подали заявки на патент США 200^{377 «Диагностика хромосомной анеуплоидии плода с использованием массового параллельного геномного секвенирования», 20110105353 «Геномный анализ плода на основе биологического образца матери» и 20110276277 «Измерение размера» геномный анализ ».RWKC и YMDL получили исследовательскую поддержку, являются консультантами и держат акции Sequenom. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.}

Введение

Полногеномный анализ внеклеточной ДНК плода в материнской плазме был достигнут с использованием массового параллельного секвенирования (MPS) [1]. Эта разработка позволила поставить точную неинвазивную диагностику хромосомных аномалий плода [2] — [5]. Помимо генетического анализа, физическое свойство ДНК плазмы было обнаружено с помощью MPS.Внеклеточные молекулы ДНК в плазме в основном связаны с нуклеосомами, причем молекулы ДНК плода, как правило, короче, чем молекулы ДНК матери [6]. В этом исследовании мы применили MPS для исследования внеклеточных молекул ДНК плода в другом типе клинически важной жидкости организма, то есть в материнской моче.

Внеклеточная ДНК в моче в основном происходит из двух источников: локально деградированная ДНК из мочевыводящих путей и трансренальная ДНК, выделяемая из плазмы [7].Феномен трансренального пассажа ДНК был продемонстрирован в различных клинических сценариях. Сообщалось о наличии мужской ДНК донорского происхождения в моче пациентов женского пола, получавших переливание крови [8]. Аналогичным образом, с использованием модели трансплантации гемопоэтических стволовых клеток несовпадающего пола, в которой было обнаружено, что большая часть ДНК плазмы реципиентов имеет генотип, полученный от донора, ДНК, полученная от донора, также обнаруживалась в моче реципиентов [9]. . У пациентов с раком носоглотки была продемонстрирована трансренальная экскреция ДНК вируса Эпштейна-Барра из плазмы в мочу [10].

Что касается беременности, то ДНК плода быстро выводится из материнской плазмы после родов с очевидным периодом полувыведения 16 мин [11]. Одним из возможных механизмов выведения является трансренальная экскреция ДНК плода с мочой матери. Однако поступали противоречивые данные о существовании ДНК плода в моче матери. Botezatu et al обнаружили ДНК плода мужского пола в восьми из десяти образцов мочи матери в первом триместре [8]. Однако Аль-Ятама и др. и Майер и др. показали, что чувствительность обнаружения ДНК плода в моче составляла только 38% и 32% соответственно [12], [13].ДНК плода в моче не обнаруживалась в трех других отчетах [14] — [16]. Впоследствии исследователи показали, что скорость обнаружения ДНК плода в моче была увеличена за счет укорачивания ампликонов ПЦР-тестов, предполагая, что фрагменты ДНК плода короткие по длине [17], [18]. Тем не менее, систематического исследования профиля размера ДНК плода в материнской моче с высоким разрешением не проводилось.

Отсутствие знаний о концентрации и целостности ДНК плода в материнской моче препятствовало развитию этой области.Фактически, предположительно низкая концентрация сильно деградированной трансренальной ДНК плода затрудняет обнаружение с помощью ПЦР. В этом исследовании мы использовали подход MPS для точного измерения фракционной концентрации молекул ДНК плода в материнской моче, а также для определения их профилей распределения по размерам с высоким разрешением.

Материалы и методы

Этическое заявление

Исследование было одобрено Комитетом по этике клинических исследований Китайского университета Гонконга.Все субъекты были набраны с письменного информированного согласия.

Участники исследования и сбор образцов

Мы набрали беременных женщин из отделения акушерства и гинекологии больницы принца Уэльского, Гонконг. Были набраны только женщины с одноплодной беременностью. У 14 беременных мы собрали катетеризованную мочу непосредственно перед кесаревым сечением и через 24 часа после родов. Спонтанно вышедшая моча была дополнительно собрана у одной из женщин через месяц после родов.Мы также собрали периферическую кровь и доставили ткани плаценты у этих женщин. Еще у девяти беременных мы собрали спонтанно вышедшую мочу перед родами. Образцы мочи спонтанного мочеиспускания были также собраны у одного мужчины и одной небеременной женщины.

Обработка образцов

Мочу собирали в стерильные простые флаконы и смешивали с EDTA, pH 8,0 (Ambion), до конечной концентрации 10 ммоль / л, чтобы ингибировать активность нуклеаз. Мы центрифугировали мочу при 1600 г в течение 10 минут при 4 ° C и фильтровали супернатант через 5-мкм фильтр (Millipore).Периферическую кровь собирали в пробирки с ЭДТА и центрифугировали при 1600 g в течение 10 мин при 4 ° C. Порцию плазмы повторно центрифугировали при 16000 г в течение 10 минут при 4 ° C. Часть клеток крови повторно центрифугировали при 2500 г в течение 5 минут и любую остаточную плазму удаляли. Все образцы хранили при -80 ° C до экстракции ДНК.

Извлечение ДНК

Мы экстрагировали ДНК из 10-40 мл фильтрованной мочи. Мы смешали 15 мл 6 М гуанидинизотиоцианата (Sigma-Aldrich) и 1 мл смолы (Wizard Plus Minipreps DNA Purification System, Promega) на каждые 10 мл мочи.Смесь инкубировали при осторожном перемешивании в течение 2 ч при комнатной температуре. Связанную с ДНК смолу затем выделяли и промывали на мини-колонках промывочным буфером, предоставленным в системе очистки ДНК Wizard Plus Minipreps (Promega), в соответствии с инструкциями производителя. ДНК элюировали в 100 мкл воды на каждые 10 мл исходного объема мочи. Мы экстрагировали ДНК из одного образца материнской плазмы по тому же протоколу, добавив 20 мл гуанидин изотиоцината и 4 мл смолы к 4 мл плазмы.ДНК выделяли из тканей плаценты и клеток крови с помощью набора для ткани QIAamp (Qiagen) и набора для крови QIAamp (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя.

Количественная ПЦР в реальном времени

Мы количественно оценили ДНК мочи с помощью ПЦР в реальном времени, направленного на ген лептина (LEP) , с праймерами 5′-CAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCA-3 ‘и 5′-CAGGATGGGGTGGAGCC-3’ и флуоресцентным зондом 5 ‘- ( VIC) CGGTTTGGACTTCA (MGBNFQ) -3 ‘(Applied Biosystems), где MGBNFQ является нефлуоресцентным гасителем, связывающимся с малыми бороздками.В результате анализа был получен ампликон длиной 62 п.н. Реакцию проводили с помощью набора реагентов TaqMan PCR Reagent Kit (Applied Biosystems) в реакционном объеме 50 мкл с использованием 600 нМ каждого праймера и 200 нМ зонда. Мы использовали 5 мкл ДНК мочи для количественного определения в системе ПЦР в реальном времени ABI 7300 (Applied Biosystems). Профиль реакции составлял 50 ° C в течение 2 минут, 95 ° C в течение 10 минут и 45 циклов при 95 ° C в течение 15 с и 58 ° C в течение 1 минуты.

SNP Генотипирование

Образцы геномной ДНК плода и матери были извлечены из тканей плаценты и клеток материнской крови, соответственно, и были генотипированы примерно на

0 SNP с помощью полногеномного массива человеческих SNP 6.0 (Affymetrix) согласно инструкциям производителя.

Секвенирование ДНК

Мы сконструировали библиотеки секвенирования с помощью набора для подготовки образцов ДНК с парными концами (Illumina) с протоколом, ранее разработанным для секвенирования ДНК плазмы [19]. Библиотеки ДНК секвенировали с помощью Genome Analyzer IIx (Illumina) или HiSeq 2000 (Illumina) с использованием формата 36 пар оснований × 2 или 50 пар оснований × 2 соответственно. Для считывания с парным концом (PE) со вставленными фрагментами ДНК короче, чем секвенированная длина, нуклеотиды, полученные из адаптера, секвенировали в конце считывания.Эти «загрязненные» последовательности адаптеров были вырезаны из считанных данных перед геномным выравниванием с помощью программы SOAP2 (http://soap.genomics.org.cn).

Для обнаружения ДНК плода с использованием подхода хромосомы Y (chrY) секвенированные чтения были сопоставлены с замаскированным повторами эталонным геномом человека (hg18) без допуска несовпадений. Для всех других анализов секвенированные считывания были сопоставлены с эталонным геномом человека без маскировки повторов (hg18), что позволило получить до двух нуклеотидных несовпадений в любом члене считывания PE.Мы включили только те чтения PE, которые были однозначно выровнены по одному месту в геноме с правильной ориентацией. Мы удалили все дублированные считывания PE, кроме одного, которые показали идентичные начальные и конечные положения выравнивания в геноме. Длину вставленной ДНК определяли из координат крайних нуклеотидов на двух концах секвенированных фрагментов. Мы включили фрагменты ДНК размером от 20 до 600 пн.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с помощью SigmaStat 3.5 (Программное обеспечение Systat). Разница со значениями P <0,05 считалась статистически значимой.

Результаты

Концентрации ДНК LEP в материнской моче

Мы стремились определить, подходит ли материнская моча, собранная через катетер или путем спонтанного мочеиспускания, для анализа ДНК плода. Мы измерили общие концентрации внеклеточной ДНК в катетеризованной и спонтанно опорожненной материнской моче, используя количественный ПЦР-анализ в реальном времени для гена LEP .Концентрации ДНК LEP в образцах мочи спонтанного мочеиспускания были значительно выше, чем в образцах катетеризованной мочи (тест Mann-Whitney Rank Sum, P <0,05) (рис. 1). Относительно высокий уровень ДНК LEP в спонтанно опорожненной моче по сравнению с катеризованной мочой, возможно, был связан с локальным высвобождением материнской ДНК из почечных эпителиальных клеток во время хранения мочи в мочевом пузыре. Поскольку нашей целью было исследование трансренальной ДНК плода в материнской моче, чтобы уменьшить влияние фоновой материнской ДНК, мы использовали катетеризованные образцы материнской мочи в последующем исследовании MPS.

Рисунок 1. LEP Концентрации ДНК в катетеризованных и спонтанно отошедших образцах материнской мочи.

Линии внутри прямоугольников обозначают медианы. Прямоугольники отмечают интервал между 25 процентилями ^-го и 75 ^-м . Усы обозначают интервал между 10 ^-м и 90 ^-м процентилями. Кружками отмечены точки данных за пределами 10 ^-го и 90 ^-го процентилей.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0048319.g001

PE Секвенирование бесклеточной ДНК в моче

Для анализа MPS мы изучили образцы мочи, взятые у одного мужчины, одной небеременной женщины и семи беременных женщин в третьем триместре беременности. В среднем 58% необработанных считываний PE были однозначно картированы в эталонном геноме человека без повторной маскировки с двумя или менее нуклеотидными несовпадениями (Таблица S1). На рисунке 2 показано распределение выровненных считываний PE среди человеческих хромосом для мужской и женской мочи, а также двух из семи материнских мочей, в которых участвовали плод мужского и женского пола.Мы выполнили линейный регрессионный анализ, чтобы сравнить хромосомное распределение выровненных считываний с ожидаемым геномным представлением каждой хромосомы в геноме человека. R ² был выше 0,95 для всех контрольных образцов и семи образцов мочи матери. Таким образом, результат продемонстрировал равномерное распределение общих молекул ДНК мочи по геному человека.

Рисунок 2. Геномное распределение фрагментов ДНК мочи по хромосомам человека.

Процент выровненных считываний PE на хромосому для образцов мочи контрольных мужчин (красные столбцы), женщин в контрольной группе (зеленые столбцы), женщины с плодом мужского пола (желтые столбцы) и женщины с плодом женского пола (синие столбцы) .Представление хромосом, как ожидалось, для диплоидного генома самки (черные полосы), не замаскированного повторами, включено для справки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0048319.g002

Фракционная концентрация ДНК плода в материнской моче: подход chrY

Мы исследовали использование последовательностей ДНК, полученных из chrY, в качестве маркеров, специфичных для плода, для оценки фракционных концентраций ДНК плода (процент плода) в моче женщин, вынашивающих плоды мужского пола. Мы подсчитали количество считываний PE, которые идеально совпадают с chrY и не-chrY эталонного генома человека с замаскированным повторами.В наших предыдущих исследованиях с использованием ДНК плазмы мы наблюдали небольшой процент неправильно выровненных считываний chrY для женских образцов [2], [19]. Следовательно, мы сначала оценили частоту ложного выравнивания chrY в случае ДНК мочи. Мы измерили хромосомный процент считываний chrY (Y%) в моче одного мужчины и одной небеременной женщины, которые составили 0,216% и 0,035% соответственно (Таблица 1 и Таблица S2). Затем мы рассчитали процент плода в образцах мочи матери с коррекцией ложного совмещения chrY, используя уравнение, описанное ранее [19]: где Y% _{материнской мочи} — Y% образцов материнской мочи, Y% _{женщины} и Y% _{мужской} — это Y% образцов мочи женщин и мужчин, которые равны 0.035% и 0,216% соответственно.

Мы измерили процент плода в моче четырех женщин, вынашивающих плод мужского пола, и трех женщин, вынашивающих плод женского пола. Если ДНК плода присутствовала в моче матери, мы ожидали более высокого процента плода в группе плодов мужского пола по сравнению с группой плодов женского пола. Однако, как показано в Таблице 1, процент плода полностью совпадал между двумя группами (диапазон для группы плодов мужского пола: 0,015% –0,198%; диапазон группы женщин и плодов: 0,036% –0,088%). Следовательно, наличие ДНК плода в моче не может быть установлено с помощью этих данных.

Мы пришли к выводу, что измерение% плода, основанное на подсчете фрагментов ДНК chrY, может быть неточным для исследования ДНК в моче. Поскольку фрагменты ДНК в моче предположительно сверхкороткие по длине, секвенированное содержимое двух членов считывания PE будет в основном перекрываться и напоминать одиночное считывание (SR) при выполнении выравнивания генома. Чтобы оценить, увеличится ли вероятность ложного выравнивания chrY для выравнивания SR, мы извлекли данные PE-секвенирования четырех образцов материнской плазмы с участием плодов женского пола из наших предыдущих исследований [2], [3].Выравнивание SR моделировалось повторным выравниванием данных только с одним элементом чтения PE. Медиана Y% из-за несовпадения для результата SR составила 0,0083%, что на 84% выше, чем у выравнивания PE (0,0045%). Следовательно, хотя измерение Y% было надежным для молекул ДНК плазмы [19], в которых большинство из них было длиннее 100 п.н. [6], [19], оно могло быть ненадежным для исследования мочи с точки зрения точности выравнивания.

Фракционная концентрация ДНК плода в материнской моче: подход SNP

Затем мы использовали подход на основе SNP для измерения процента плода в материнской моче.Для идентификации фрагментов ДНК плода мы использовали информативные SNP, в которых мать была гомозиготной (AA), а плод был гетерозиготным (AB) по генотипу. Подсчитывали количество считываний PE, содержащих специфический для плода аллель (аллель B), а также аллель, общий для матери и плода (аллель A). Долю последовательностей ДНК, содержащих специфичный для плода аллель, рассчитывали по уравнению:

Считалось, что ДНК плода присутствует, если соотношение аллелей плода было выше предела обнаружения (LOD) (методы S1).Для образцов мочи матери с долей аллелей плода> LOD процент плода дополнительно рассчитывали по формуле:

ДНК плода была обнаружена в пяти из семи образцов мочи матери с процентным содержанием плода от 1,92% до 4,73% (таблица 2 и таблица S3). Мы также проанализировали образцы мочи, взятые у этих беременных женщин через 24 часа после родов. ДНК плода не была обнаружена ни в одном образце мочи после родов (таблица 2). В случае 8542 процент плода снизился с 3,85% до 1,38% после родов.Чтобы выяснить, может ли в этом случае сохраняться ДНК плода в моче, через месяц после родов у женщины был взят дополнительный образец мочи. ДНК плода в этом образце больше не обнаруживалась (таблица 2). Таким образом, используя подход SNP, мы подтвердили, что внеклеточная ДНК плода присутствовала в материнской моче и исчезла после родов.

Распределение бесклеточной ДНК в моче матери по размерам

Сначала мы сравнили распределение размеров бесклеточных молекул ДНК в образцах плазмы и мочи, собранных в случае 6918.Размеры ДНК плода были выведены из считываний PE с аллелями, специфичными для плода. Размеры материнской ДНК были выведены из считываний PE общего аллеля, потому что более 95% этих считываний были получены от матери (таблица 2).

Как показано на рисунке 3А, распределение фрагментов ДНК плазмы по размерам соответствовало предыдущим исследованиям [6]. Фрагменты материнской ДНК чаще всего имели размер 166 п.н., а ДНК плода обычно была короче материнской ДНК [20]. С другой стороны, в материнской моче фрагменты материнской ДНК были намного короче, чем в плазме (рис. 3B).Большинство фрагментов материнской ДНК в моче имели размер менее 100 п.н. с наблюдаемой периодичностью пиков 10 п.н. Что еще более важно, мы обнаружили, что фрагменты ДНК плода были очень короткими в материнской моче и имели преобладающий пик на 29 п.н. (Рисунок 3B). На рис. 4 показано распределение размеров других четырех образцов мочи матери, в которых была обнаружена ДНК плода (таблица 2). В целом, распределение по размерам ДНК плода в моче было одинаковым для всех пяти образцов материнской мочи (Рисунки 3B и 4), с преобладающими пиками, наблюдаемыми при размерах ДНК в диапазоне от 29 до 45 пар оснований.

Рис. 3. Сравнение распределения размеров фрагментов ДНК плазмы и мочи.

Распределение по размерам ДНК плода (красные кривые), материнской ДНК (синие кривые) и митохондриальной ДНК (серые кривые) в (A) материнской плазме и (B) материнской моче для случая 6918. Число обозначает размер ДНК преобладающего пик ДНК плода в моче.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0048319.g003

В отличие от ядерной ДНК, распределение митохондриальной ДНК по размеру было схожим в образцах плазмы и мочи (рис. 3).

Основываясь на результатах распределения по размерам, мы пришли к выводу, что молекулы внеклеточной ДНК в моче были более разрушены, чем в плазме. Кроме того, фрагменты ДНК плода в моче матери были очень короткими.

Обсуждение

В этом исследовании мы подтвердили, что ДНК плода действительно присутствует в материнской моче. Используя MPS, мы смогли обнаружить внеклеточную ДНК плода в пяти из семи (71%) образцов материнской мочи. ДНК плода составляла в среднем 3,85% от общей ДНК в материнской моче, что было очень низким по сравнению с% плода в материнской плазме при одинаковых сроках беременности, т.е.е., 20,4% [21]. Наблюдаемые молекулы ДНК плода в моче, скорее всего, были получены в результате трансренальной экскреции ДНК плода в плазме матери. Это основано на наблюдении, что ДНК плода отсутствует в большинстве образцов мочи матери через 24 часа после родов, и согласуется с предыдущим сообщением о быстром удалении ДНК плода из плазмы матери после родов [11]. В этом исследовании мы изучили только один момент времени после родов, то есть через 24 часа после родов. Для дальнейшего изучения кинетики трансренального клиренса ДНК плода из плазмы было бы интересно сравнить процент плода в плазме и моче, собранных последовательно после родов.

В этом исследовании мы также определили целостность внеклеточной ДНК в материнской моче. Фрагменты ДНК плода были очень короткими, с преобладающими пиками размером от 29 до 45 п.н. (Рисунки 3 и 4). Низкая целостность ДНК плода в моче может быть вызвана несколькими факторами. В материнской плазме только субпопуляция фрагментов ДНК плода размером меньше почечного фильтра [22] могла выйти с мочой. После попадания в мочу ДНК плода может подвергаться тяжелой деградации, поскольку нуклеазная активность в моче, как сообщается, в 4 раза выше, чем в плазме [23].Кроме того, в то время как ДНК плода наматывается на нуклеосомы в материнской плазме [6], еще предстоит выяснить, защищена ли ДНК плода в моче путем связывания с какими-либо биомолекулами.

Рис. 4. Распределение по размерам фрагментов ДНК в моче матери.

Распределение размеров ДНК плода (красные кривые) и материнской ДНК (синие кривые) в материнской моче в случаях 6849, 7413, 7482 и 8542. Числа обозначают размеры ДНК преобладающего пика ДНК плода в моче в каждом образце.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0048319.g004

Молекулы ДНК материнского происхождения из мочи могут выделяться как трансренально, так и локально. В нашем предыдущем исследовании с использованием модели трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, в то время как 76% молекул ДНК плазмы реципиента были обнаружены донорским происхождением, такая донорская ДНК составляла 38% внеклеточной ДНК в моче реципиента [9]. Это открытие предполагает, что часть внеклеточных молекул ДНК в моче происходит трансренально из плазмы.Клетки почечного эпителия могут представлять собой еще один источник внеклеточной ДНК в моче. Распределение по размерам материнской ДНК в моче показало периодичность в 10 п.н. (Рисунки 3 и 4), что напоминало картину нуклеазного расщепления связанных с нуклеосомами фрагментов ДНК плазмы [6], [19]. Следовательно, такие молекулы материнской ДНК мочи могут локально высвобождаться из эпителиальных клеток посредством апоптоза [24]. Относительный вклад внеклеточной ДНК мочи из различных биологических источников может быть дополнительно исследован, возможно, с использованием модели трансплантации почки [25], [26].В целом, общие внеклеточные молекулы ДНК в моче были менее интактными, чем в плазме (рис. 3). Возможно, это связано с сильной нуклеазной активностью в моче [23]. В отличие от ядерной ДНК, мы обнаружили, что распределение митохондриальной ДНК по размерам в плазме и моче в значительной степени схоже (рис. 3). Одна из причин может быть связана с кольцевой структурой молекул митохондриальной ДНК, которая может сделать их менее восприимчивыми к деградации экзонуклеазами [27].

Наше открытие распределения плодной ДНК по размерам в материнской моче может объяснить противоречивые результаты, полученные в предыдущих отчетах относительно трансренальной ДНК плода.Для обнаружения ДНК плода в материнской моче в большинстве этих отчетов использовались ПЦР с размерами ампликонов от 63 до 393 пар оснований [8], [12] — [17], что может быть неэффективным для выявления чрезвычайно коротких матриц ДНК плода. Тестируя ПЦР с ампликонами от 25 до 88 пар оснований, Shekhtman и др. показали, что частота обнаружения ДНК плода в материнской моче была самой высокой для ампликона ПЦР размером 25 пар оснований [18]. В текущем исследовании мы использовали формат PE MPS для изучения внеклеточной ДНК в надосадочных жидкостях мочи.Система способна обнаруживать чрезвычайно короткие фрагменты ДНК (≥20 п.н.) и измерять длину отдельных фрагментов с разрешением по одному основанию. Таким образом, мы впервые выявили распределение с высоким разрешением по размерам ДНК плода и матери в материнской моче.

В заключение, это исследование предоставило твердые доказательства существования внеклеточной ДНК плода в материнской моче. Биологически результат предполагает, что почечный клиренс может быть одним из механизмов удаления ДНК плода из материнской плазмы.Клинически результаты могут открыть новые возможности для неинвазивных диагностических приложений. Поскольку трансренальный пассаж ДНК плода зависит от почечного фильтра, одним из непосредственных приложений было бы изучение связанных с почками патологий, таких как преэклампсия [28]. Помимо беременности, результат этого исследования может иметь значение для других клинических ситуаций, таких как диагностика рака [29] — [31] и мониторинг трансплантации почки [25], [32].

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: NBYT KCAC RWKC YMDL.Проведены эксперименты: NBYT KCKC. Проанализированы данные: NBYT PJ XS HS. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: TYL. Написал статью: NBYT YMDL.

Ссылки

1. 1. Lo YMD, Chiu RWK (2012) Геномный анализ нуклеиновых кислот плода в материнской крови. Анну Рев Геномикс Хум Генет 13: 10.11–10.22.
2. 2. Chiu RWK, Chan KCA, Gao Y, Lau VYM, Zheng W и др. (2008) Неинвазивная пренатальная диагностика хромосомной анеуплоидии плода путем массового параллельного геномного секвенирования ДНК в плазме крови матери.Proc Natl Acad Sci U S A 105: 20458–20463.
3. 3. Chiu RWK, Akolekar R, Zheng YWL, Leung TY, Sun H и др. (2011) Неинвазивная пренатальная оценка трисомии 21 путем мультиплексного секвенирования ДНК материнской плазмы: крупномасштабное исследование достоверности. BMJ 342: c7401.
4. 4. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, Neveux LM, et al. (2011) Секвенирование ДНК материнской плазмы для выявления синдрома Дауна: международное клиническое валидационное исследование. Genet Med 13: 913–920.
5. 5. Бьянки Д.В., Платт Л.Д., Голдберг Д.Д., Абухамад А.З., Зенерт А.Дж. и др. (2012) Полногеномное определение анеуплоидии плода с помощью секвенирования ДНК материнской плазмы. Obstet Gynecol 119: 890–901.
6. 6. Lo YMD, Chan KCA, Sun H, Chen EZ, Jiang P и др. (2010) Секвенирование ДНК материнской плазмы выявляет генетический и мутационный профиль плода по всему геному. Sci Transl Med 2: 61ra91.
7. 7. Уманский С.Р., Томей Л.Д. (2006) Трансренальное ДНК-тестирование: прогресс и перспективы.Эксперт Рев Мол Диаг 6: 153–163.
8. 8. Ботезату И., Сердюк О., Потапова Г., Шелепов В., Алехина Р. и др. (2000) Генетический анализ ДНК, выделяемой с мочой: новый подход к обнаружению специфических последовательностей геномной ДНК из клеток, умирающих в организме. Clin Chem 46: 1078–1084.
9. 9. Hung ECW, Shing TKF, Chim SSC, Yeung PC, Chan RW и др. (2009) Присутствие донорской ДНК и клеток в моче несоответствующих по полу реципиентов трансплантата гемопоэтических стволовых клеток: значение для трансренальной гипотезы.Clin Chem 55: 715–722.
10. 10. Chan KCA, Leung SF, Yeung SW, Chan AT, Lo YMD (2008) Количественный анализ трансренальной экскреции циркулирующей ДНК EBV у пациентов с раком носоглотки. Clin Cancer Res 14: 4809–4813.
11. 11. Lo YMD, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang AM и др. (1999) Быстрое удаление ДНК плода из материнской плазмы. Am J Hum Genet 64: 218–224.
12. 12. Аль-Ятама М.К., Мустафа А.С., Али С., Абрахам С., Хан З. и др.(2001) Обнаружение ДНК, специфичной для Y-хромосомы, в плазме и моче беременных женщин с помощью вложенной полимеразной цепной реакции. Пренат Диаг 21: 399–402.
13. 13. Majer S, Bauer M, Magnet E, Strele A, Giegerl E, et al. (2007) Материнская моча для пренатальной диагностики — анализ внеклеточной ДНК плода в материнской моче и плазме в третьем триместре. Пренат Диаг 27: 1219–1223.
14. 14. Чжун XY, Хан Д., Троегер С., Клемм А., Штейн Г. и др. (2001) Бесклеточная ДНК в моче: маркер отторжения трансплантата почки, но не для пренатальной диагностики? Ann N Y Acad Sci 945: 250–257.
15. 15. Ли Y, Чжун XY, Канг А., Троегер С., Хольцгрев В. и др. (2003) Неспособность обнаружить внеклеточную ДНК плода в моче здоровых беременных женщин и женщин, страдающих HELLP-синдромом, связанным с преэклампсией. Исследование J Soc Gynecol 10: 503–508.
16. 16. Илланес С., Денбоу М.Л., Смит Р.П., Овертон Т.Г., Соотилл П.В. и др. (2006) Обнаружение внеклеточной ДНК плода в моче матери. Пренат Диаг 26: 1216–1218.
17. 17. Коиде К., Секизава А., Ивасаки М., Мацуока Р., Хонма С. и др.(2005) Фрагментация внеклеточной ДНК плода в плазме и моче беременных женщин. Пренат Диаг 25: 604–607.
18. 18. Шехтман Э.М., Анне К., Мелконян Х.С., Роббинс Д.Д., Warsof SL и др. (2009) Оптимизация анализа трансренальной ДНК: обнаружение ДНК плода в моче матери. Clin Chem 55: 723–729.
19. 19. Zheng YWL, Chan KCA, Sun H, Jiang P, Su X и ​​др. (2012) ДНК негематопоэтического происхождения в плазме короче, чем ДНК гематопоэтического происхождения: модель трансплантации.Clin Chem 58: 549–558.
20. 20. Чан КСА, Чжан Дж., Хуэй А.Б., Вонг Н., Лау Т.К. и др. (2004) Распределение ДНК матери и плода в плазме крови матери. Clin Chem 50: 88–92.
21. 21. Lun FMF, Chiu RWK, Chan KCA, Leung TY, Lau TK и др. (2008) Цифровая ПЦР Microfluidics выявила более высокую, чем ожидалось, долю ДНК плода в материнской плазме. Clin Chem 54: 1664–1672.
22. 22. Трюггвасон К., Вартиоваара Дж. (2005) Как почки фильтруют плазму? Физиология (Bethesda) 20: 96–101.
23. 23. Черепанова А, Тамкович С, Пышный Д, Харькова М, Власов В и др. (2007) Иммунохимический анализ активности дезоксирибонуклеазы в жидкостях организма. J Immunol Methods 325: 96–103.
24. 24. Котник В., Премзл А., Скоберн М., Маловрх Т., Кведер Р. и др. (2003) Демонстрация продуктов расщепления ДНК, связанных с апоптозом, продуктов активации комплемента SC5b-9 и C3d / dg, а также иммунных комплексов CIC-C3d, CIC-IgA и CIC-IgG в моче пациентов с мембранозным гломерулонефритом.Croat Med J 44: 707–711.
25. 25. Чжан Дж., Тонг К.Л., Ли П.К., Чан А.Ю., Йунг С.К. и др. (1999) Присутствие ДНК донора и реципиента в бесклеточных образцах мочи реципиентов трансплантации почки: химеризм ДНК в моче. Clin Chem 45: 1741-1746.
26. 26. Li Y, Hahn D, Holzgreve W, Hahn S (2005) Готовое обнаружение донор-специфичных однонуклеотидных полиморфизмов в моче реципиентов почечного трансплантата с помощью масс-спектрометрии с лазерной десорбцией / ионизацией по времени пролета с использованием матрицы.Clin Chem 51: 1903–1904.
27. 27. Foran DR (2006) Относительная деградация ядерной и митохондриальной ДНК: экспериментальный подход. J Forensic Sci 51: 766–770.
28. 28. Лау Т.В., Леунг Т.Н., Чан ЛИС, Лау Т.К., Чан КСА и др. (2002) Выведение ДНК плода из материнской плазмы нарушается при преэклампсии. Clin Chem 48: 2141–2146.
29. 29. Су Й.Х., Ван М., Бреннер Д.Е., Нг А., Мелконян Х. и др. (2004) Человеческая моча содержит небольшую, размером от 150 до 250 нуклеотидов, растворимую ДНК, полученную из кровотока, и может быть полезной при обнаружении колоректального рака.J Mol Diagn 6: 101–107.
30. 30. Кэрнс П. (2007) Метилирование генов и раннее выявление рака мочеполовой системы: путь вперед. Nat Rev Cancer 7: 531–543.
31. 31. Lodde M, Fradet Y (2008) Обнаружение генетических маркеров рака мочевого пузыря в моче и сыворотке. Curr Opin Urol 18: 499–503.
32. 32. Гарсия Морейра V, Прието Гарсия Б., Балтар Мартин Дж. М., Ортега Суарес Ф., Альварес Ф. В. (2009) Бесклеточная ДНК как неинвазивный маркер острого отторжения при трансплантации почек.Clin Chem 55: 1958-1966.

Вентрикуломегалия

Что такое вентрикуломегалия?

Двумя компонентами центральной нервной системы являются головной и спинной мозг. Вся поверхность головного и спинного мозга омывается прозрачной бесцветной жидкостью, называемой спинномозговой жидкостью (CSF). Спинномозговая жидкость — это прозрачная водянистая жидкость, которая окружает головной и спинной мозг, а также находится во всех желудочках (полостях и туннелях головного мозга).CSF защищает головной и спинной мозг от толчков.

Вентрикуломегалия — это когда заполненные жидкостью структуры (боковые желудочки) в головном мозге становятся слишком большими. Во время беременности вам сделают УЗИ. С помощью УЗИ врач осмотрит мозг вашего плода и измерит количество желудочков. Если размер боковых желудочков составляет 10 миллиметров или больше, вам сообщат, что у вашего плода «вентрикуломегалия».

Иногда УЗИ показывает только один из желудочков, хотя их два (один справа и один слева).Вентрикуломегалия чаще встречается у плодов мужского пола, чем у плодов женского пола.

Каков исход для плода с вентрикуломегалией?

Исход вентрикуломегалии зависит от нескольких факторов, включая фактический размер желудочков, наличие или отсутствие каких-либо других результатов ультразвукового исследования, таких как агенезия мозолистого тела, и результатов амниоцентеза. В общем, результат хуже, когда желудочки больше, амниоцентез не соответствует норме или есть другие проблемы, видимые на УЗИ.Наилучший результат обычно наблюдается, когда: 1. желудочки плода лишь незначительно увеличены (их размер составляет 10-15 миллиметров; 2.) когда на УЗИ нет других проблем; 3.) генетическое исследование. результаты нормальные — это называется «изолированная легкая вентрикуломегалия».

Трудно определить точный результат для здоровья вашего ребенка. Самый частый эффект у ребенка — задержка в развитии. Похоже, это связано с размером желудочков. В настоящее время мы изучаем МРТ плода, чтобы выяснить, может ли информация, полученная с помощью МРТ плода, сказать нам о вероятности инвалидности и предоставить семьям больше информации о том, чего ожидать от здоровья и развития их ребенка.Эта информация поможет родителям принимать решения во время беременности и заранее подготовиться к трудностям, с которыми могут столкнуться их ребенок и семья.

Насколько серьезна вентрикуломегалия у моего плода?

Если ваш врач обнаружит вентрикуломегалию, он может направить вас на несколько анализов. К ним относятся более подробное УЗИ (часто называемое «УЗИ уровня II» или «Обследование плода»), амниоцентез и / или микроматрица (для изучения генетического состава вашего плода и выявления любых признаков инфекции) и плода. магнитно-резонансная томография (МРТ плода).

МРТ плода — еще один способ безопасно изучить мозг плода. Он дает снимки мозга вашего плода с использованием технологий, отличных от ультразвуковых. Поскольку в нем используется другая технология, МРТ плода может обнаруживать другие проблемы в мозге вашего плода, которые невозможно обнаружить на УЗИ. Затем мы сможем просмотреть результаты всех тестов вместе, и ваш врач сможет обсудить с вами значение этих результатов.

Для получения дополнительной информации о МРТ плода посетите UCSF Baby Brain — Fetal MRI

Что я могу сделать во время этой беременности?

Для плодов с вентрикуломегалией не существует лечения до рождения.Лечение после родов включает устранение симптомов у ребенка. Во время беременности важно получить подробный диагноз (с помощью подробного УЗИ, амниоцентеза и МРТ), чтобы определить, есть ли какие-либо дополнительные проблемы. Наши сотрудники могут поговорить с вами о результатах этих тестов и сообщить, с какими проблемами вы можете столкнуться. Если есть доказательства более серьезных нарушений, требующих длительного ухода, мы можем помочь направить вас к соответствующим специалистам.

Гидроцефел и вентрикулоперитонеальный шунт (ВП шунт)

Если анализы показывают, что спинномозговая жидкость вашего ребенка плохо оттекает, то показана гидроцефалия.Гидроцефалия — это скопление спинномозговой жидкости, которая оказывает давление на мозг. В такой ситуации может быть рекомендован вентрикулоперитонеальный шунт (VP-шунт). Гидроцефелия — это прогрессирующая проблема, поэтому обычно жидкость накапливается медленно в течение нескольких недель после рождения ребенка. В большинстве случаев мы узнаем к 6 месяцам, понадобится ли вашему ребенку шунт VP.

Шунт VP — это хирургическая имплантация небольшого пластикового катетера, который отводит спинномозговую жидкость в ту часть тела, которая может легко абсорбировать жидкость, например, в брюшную полость или брюшину (мембрану, которая образует выстилку брюшной полости).Процедура шунтирования VP будет выполняться детским нейрохирургом. Это очень безопасная процедура, которая может помочь развитию вашего ребенка, поскольку помогает снизить давление на мозг, вызванное накоплением спинномозговой жидкости. Вашему ребенку не придется оставаться в больнице, так как шунт находится под кожей. Многие люди живут здоровой жизнью с шунтом VP. Пациентам с шунтом VP потребуется регулярное наблюдение с нейрохирургией, чтобы убедиться, что шунт продолжает функционировать должным образом.

Группы поддержки и другие ресурсы

• March of Dimes — Исследователи, волонтеры, педагоги, аутрич-работники и правозащитники работают вместе, чтобы дать всем младенцам шанс на борьбу
• «Исследование врожденных дефектов у детей» — служба родительской сети, объединяющая семьи, у которых есть дети с такими же врожденными дефектами
• Kids Health — утвержденная врачом информация о здоровье детей от до рождения до подросткового возраста
• CDC — Врожденные дефекты — Dept.здравоохранения и социальных служб, Центры по контролю и профилактике заболеваний
• NIH — Управление редких заболеваний — Национальный институт. здравоохранения — Управление редких заболеваний
• Североамериканская сеть терапии плода — NAFTNet (Североамериканская сеть терапии плода) — это добровольная ассоциация медицинских центров в Соединенных Штатах и ​​Канаде, обладающих обширным опытом в области хирургии плода и других форм многопрофильной помощи при сложных заболеваниях плода.

Анализ распределения размеров внеклеточной ДНК плода и матери путем секвенирования парных концов | Клиническая химия

ИСТОРИЯ ВОПРОСА

Неинвазивная пренатальная диагностика с использованием внеклеточной ДНК в плазме матери является сложной задачей, поскольку только небольшая часть образца ДНК происходит от плода.Несколько предыдущих исследований предоставили оценки диапазона размеров материнской и плодной ДНК, но прямое измерение распределений по размерам затруднено из-за небольшого количества внеклеточной ДНК.

МЕТОДЫ

Мы использовали высокопроизводительное парное секвенирование, чтобы напрямую измерить распределение размеров материнской и плодной ДНК в бесклеточной материнской плазме, собранной от 3 типичных диплоидных и 4 анеуплоидных беременностей у мужчин. В качестве контроля также секвенировали рестрикционные фрагменты λ ДНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Бесклеточная ДНК имела доминирующий пик примерно на 162 п.н. и минорный пик примерно на 340 п.н. Последовательности хромосомы Y редко были длиннее 250 п.н., но присутствовали размером <150 п.н. в большей пропорции по сравнению с остальными последовательностями. Селективный анализ самых коротких фрагментов обычно увеличивает фракцию ДНК плода, но не обязательно увеличивает чувствительность обнаружения анеуплоидии из-за уменьшения количества подсчитываемых молекул ДНК.Предпочтительно секвенировали рестрикционные фрагменты λ-ДНК размером от 60 до 120 пар оснований, что указывает на то, что рабочий процесс секвенирования с дробовиком привел к смещению в сторону более коротких фрагментов.

ВЫВОДЫ

Наши результаты подтверждают, что ДНК плода короче материнской. Однако обогащение ДНК плода путем отбора по размеру может не обеспечить резкого увеличения чувствительности анализов, основанных на измерении длины in situ, из-за компромисса между фракцией ДНК плода и количеством подсчитываемых молекул.

Традиционные методы пренатальной диагностики генетических нарушений используют материалы, полученные с помощью амниоцентеза или биопсии ворсин хориона, инвазивных процедур, которые несут небольшой, но очевидный риск выкидыша (1). Открытие бесклеточных нуклеиновых кислот плода в плазме беременных матерей привело к разработке нескольких неинвазивных методов пренатальной диагностики за последнее десятилетие (2). Выявление анеуплоидии плода и аутосомно-рецессивных заболеваний с помощью бесклеточных нуклеиновых кислот является особенно сложной задачей, поскольку только небольшая часть бесклеточных нуклеиновых кислот в материнской плазме происходит от плода.Недавно мы продемонстрировали неинвазивное обнаружение анеуплоидии плода с помощью высокопроизводительного секвенирования внеклеточной ДНК (3), и независимая группа быстро воспроизвела наши результаты (4, 5). Практически для всех пренатальных диагностических анализов фон материнской ДНК обеспечивает практический предел чувствительности, и поэтому доля ДНК плода, присутствующая в материнской плазме, является критическим параметром. Имеются данные о том, что ДНК плода в целом короче, чем ДНК матери, и поэтому значительные усилия были вложены в разработку методов обогащения ДНК плода (6, 7).Извлечение фракций ДНК с более низкой молекулярной массой с помощью электрофоретических методов или использование меньших ампликонов ПЦР может увеличить долю ДНК плода, и такие методы используются для улучшения выявления точечных мутаций плода и определения генотипов плода (8–12) .

Секвенирование парных концов — это метод, позволяющий получить информацию о последовательности для обоих концов каждой молекулы ДНК. Найдя координаты двух последовательностей в геноме посредством выравнивания последовательностей, можно определить длину фрагмента ДНК.Один эксперимент по секвенированию дает информацию о последовательности и размере десятков миллионов фрагментов ДНК. В этом исследовании мы использовали высокопроизводительное секвенирование парных концов внеклеточной ДНК в материнской плазме для изучения распределения длин ДНК плода и матери. Парное секвенирование позволило нам напрямую измерить распределение размеров материнской ДНК и ДНК плода с разрешением по одному основанию из бесклеточной ДНК, собранной у женщин, вынашивающих плод мужского пола, без необходимости объединения образцов и с гораздо большей точностью, чем можно получить гель-электрофорезом или с помощью ПЦР.Наши данные подтверждают, что ДНК плода короче материнской и преимущественно соответствует размеру мононуклеосомы. Мы продемонстрировали, что рабочий процесс секвенирования с дробовиком приводит к смещению в сторону более коротких фрагментов — феномен, который эффективно обогащает фракцию ДНК плода. Наконец, выборочно проанализировав только самые короткие фрагменты, мы показали, что существует тонкий компромисс в чувствительности обнаружения анеуплоидии плода между фракцией ДНК плода и количеством подсчитанных молекул.

Материалы и методы

ОБРАБОТКА ОБРАЗЦОВ

Образцы крови были собраны в детской больнице Люсиль Паккард (Стэнфордский университет) с информированного согласия, полученного в рамках исследования, одобренного институциональным наблюдательным советом. Для этого исследования были отобраны образцы материнской крови от 7 беременностей плодом мужского пола, включая 2 случая трисомии 21, случай трисомии 13 и случай трисомии 18. Эти образцы были собраны на сроке гестации 12–23 недель.Сначала плазму отделяли от клеток крови центрифугированием при 1600 g при 4 ° C в течение 10 мин. Затем плазму центрифугировали при 16 000 g в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления остаточных клеток. ДНК экстрагировали из 1,6–2,4 мл бесклеточной плазмы с помощью набора NucleoSpin Plasma F (Macherey-Nagel; приобретен у E&K Scientific). Чтобы измерить количество внеклеточной ДНК, мы провели в реальном времени анализ TaqMan PCR, специфичный для локуса хромосомы 1 и локуса хромосомы Y (3).

Для исследования систематической ошибки секвенирования, зависящей от длины фрагмента, мы приготовили рестрикционный гидролизат λ ДНК (Invitrogen). λ ДНК расщепляли резаком из 4 п.н. Alu I в течение 2 ч при 37 ° C. Затем гидролизат нагревали при 65 ° C в течение 20 минут для инактивации фермента. Переваривание очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), и 5 нг очищенной ДНК использовали для создания библиотеки секвенирования.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО СТРОИТЕЛЬСТВО БИБЛИОТЕКИ

Комбинация протоколов, подробно описанных в Kozarewa et al.(13) и Fan et al. (3) были использованы для создания библиотек секвенирования Illumina. Чтобы сохранить исходную длину ДНК плазмы, мы не проводили процедуры фрагментации. Полноразмерные адаптеры секвенирования с парным концом лигировали непосредственно на полированную по концам двухцепочечную плазменную ДНК с А-хвостом. Адаптеры очищали с помощью ВЭЖХ и обрабатывали полинуклеотидкиназой Т ₄ для фосфорилирования 5′-концов. Конечная концентрация адаптеров в реакции лигирования составляла 800 пмоль / л. Библиотеки амплифицировали с помощью 12 циклов ПЦР.Очистку геля агарозы не проводили. Для анализа библиотек использовали биоанализатор (Agilent Technologies) и набор High Sensitivity DNA Kit. Количественную оценку библиотек проводили с помощью традиционных ПЦР TaqMan в реальном времени с праймерами, специфичными для человека, и цифровой ПЦР (Fluidigm) с универсальным анализом матрицы (14), разработанным для библиотек с парными концами. Подробную информацию о протоколах подготовки библиотеки и последовательностях адаптеров можно найти в файлах дополнения к данным, которые прилагаются к онлайн-версии этой статьи по адресу http: // www.Clinchem.org/content/vol56/issue8.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

библиотек секвенировали на Genome Analyzer II (Illumina) в соответствии с инструкциями производителя. Были секвенированы 32 основания на каждом конце.

ВЫРАВНИВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Анализ изображений, базовый вызов и выравнивание выполнялись с помощью программного обеспечения Illumina Pipeline (версия 1.4.0). Для библиотек ДНК плазмы мы использовали опцию ELAND_PAIR для сопоставления первых 25 оснований каждого секвенированного конца с эталонным геномом человека (сборка NCBI 36).

Для выравнивания расщепления ДНК λ первые 2 цикла на обоих концах были опущены, потому что они соответствовали последовательностям сайтов рестрикции и потому что преобладание определенных оснований в первом цикле вызывало проблемы калибровки в программном обеспечении для анализа изображений. Последовательности были сопоставлены с геномом λ ДНК (номер доступа в GenBank J02459).

Программное обеспечение Pipeline выводит файлы, которые предоставляют информацию, включающую последовательность считывания, хромосому, координату прямой цепи, с которой сопоставлен 5 ‘конец считывания с не более чем двумя несовпадениями, и смещение координат, если парное read также сопоставлен с той же хромосомой.

АНАЛИЗ ДАННЫХ

Пользовательские сценарии Python и MATLAB были написаны для дальнейшего анализа данных. Абсолютное значение смещения координат плюс 25 оснований интерпретировали как длину секвенированного фрагмента ДНК. Мы использовали только те чтения, у которых один конец был сопоставлен с прямой цепью, а другой — с обратной цепью. Кроме того, для парных чтений, при которых первое чтение сопоставлено с прямой цепью, значение смещения в принципе должно быть> 0, тогда как для парных считываний с первым считыванием, сопоставленным с обратной цепью, значение смещения должно быть <0 (см. Рис. .1 в онлайн-дополнении к данным). Чтения, не соответствующие этому правилу, были отфильтрованы.

Для последовательностей λ ДНК мы подсчитали количество прочтений, картированных на каждый сайт рестрикции, и проигнорировали сайты с длиной рестрикционных фрагментов <30 п.н. (поскольку для выравнивания использовалось 25 п.н.). Данные были разделены на интервалы по 20 пар оснований от 30 до 2500 пар оснований. Для каждого бина 20 п.н. мы подсчитали количество считываний для всех фрагментов рестрикционного дайджеста, попадающих в бункер из 20 п.н., и разделили его на количество рестрикционных дайджестов в бункере.Мы подобрали данные с помощью локально взвешенной логистической регрессии.

Чтобы измерить распределение длин материнской и плодной ДНК, мы подсчитали количество считываний, которые имели размер от 30 до 510 пар оснований с интервалами 20 пар оснований для каждой хромосомы. Мы применили взвешивание к каждой точке данных, используя подогнанные данные λ ДНК, чтобы исправить ошибку секвенирования, зависящую от длины. Для каждого бина из 20 п.н. мы рассчитали кратное увеличение фракции ДНК плода следующим образом: где f _i — количество последовательностей плода (хромосома Y) в интервале i и t _i — это количество всех последовательностей в интервале –.

Как и в нашем предыдущем исследовании (3), мы наблюдали смещение GC в охвате чтения. Чтобы уменьшить влияние такого смещения, мы следовали процедурам, описанным Fan и Quake (15). Избыточное и недопредставленное хромосомы измерялось, а фракция плода оценивалась по истощению последовательностей хромосомы X и / или избытку хромосомы 18, 13 или 21, как описано в нашем предыдущем исследовании (3).

Результаты

АНАЛИЗ ЗАВИСИМОГО ОТ ДЛИНЫ СМЕЩЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ИЛЛЮМИНА

Мы использовали рестрикционный гидролизат λ ДНК для изучения влияния подготовки библиотеки и секвенирования на распределение длины ДНК.Мы подготовили библиотеку секвенирования из Alu I-расщепленной λ ДНК, которая имела общее количество ДНК, аналогичное количеству ДНК в образцах плазмы. Секвенирование на одной дорожке проточной кюветы дало приблизительно 14 × 10 ⁶ считываний парных концов, 97% из которых были сопоставлены с сайтами рестрикции с предсказанной длиной фрагмента и использовались для последующего анализа (см. Таблицу 1 в онлайн-дополнении к данным. ). Фиг.1 представляет собой график зависимости количества прочтений от длины рестрикционного фрагмента. Бины с 60–120 п.н. имели наибольшее количество прочтений.Количество прочтений быстро уменьшалось по мере увеличения размера фрагмента. Было секвенировано очень мало фрагментов размером> 1 т.п.н.

Влияние подготовки библиотеки и секвенирования на распределение длины ДНК.

Рис. 1.

ДНК

λ расщепляли Alu I, а затем секвенировали по парным концам. Число секвенированных фрагментов отложено в зависимости от длины. Каждая черная точка представляет собой среднее количество считываний в каждой ячейке с 20 битами. Красная линия соответствует локально взвешенной логистической регрессии.

Рис. 1.

Влияние подготовки библиотеки и секвенирования на распределение длины ДНК.

ДНК

λ расщепляли Alu I и затем секвенировали по парным концам. Число секвенированных фрагментов отложено в зависимости от длины. Каждая черная точка представляет собой среднее количество считываний в каждой ячейке с 20 битами. Красная линия соответствует локально взвешенной логистической регрессии.

РАЗМЕРНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ И ФЕТАЛЬНОЙ ДНК В ПЛАЗМЕ МАТЕРИ, ОПРЕДЕЛЕННОЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ПО ПАРНЫМ КОНЦАМ

С помощью ПЦР в реальном времени мы определили, что концентрации внеклеточной ДНК плазмы в 7 секвенированных образцах находятся в пределах 0.7–5,6 мкг / л плазмы (при условии 6,6 мкг / геном). DYS14, Y-специфическая последовательность хромосомы, была обнаружена во всех образцах от мужских плодных беременностей и не была обнаружена в женской контрольной геномной ДНК.

В таблице 2 онлайн-приложения к данным представлены статистические данные по парному секвенированию и подробная информация об образцах плазмы. Среднее число общих считываний составило приблизительно 19 × 10 ⁶ , причем около 52% (т.е. 10 × 10 ⁶ считываний) имели оба конца, сопоставленные с 2 уникальными местоположениями на одной хромосоме с не более чем 2 несовпадениями.Чтения с парным концом отображаются в прямой и обратной цепях в равных пропорциях. Мы отфильтровали чтения, концы которых были сопоставлены с одной и той же цепью, и чтения, которые не имели разумных значений смещения (т.е. значения, которые были слишком большими по сравнению с верхним пределом размера ампликона для реакции ПЦР). Остальные считывания (примерно 99,5% всех парных считываний) были использованы для последующих анализов.

Среднее число считываний хромосомы Y составило приблизительно 13 000, что эквивалентно приблизительно 0.1% от общего числа парных чтений. На рис. 2 представлено распределение размеров секвенированной внеклеточной ДНК по хромосомам. Размеры варьировались от 30 до 510 п.н. в ячейках по 20 п.н. Средняя длина составила 162 п.н. Мы применили взвешивание к распределению длин, используя значения аппроксимации Лесса из рис. 1. Доминирующий пик составлял приблизительно 162 п.н., что приблизительно равно размеру монохроматосомы. Также наблюдался минорный пик примерно на 340 п.н., что примерно равно размеру дихроматосомы.

Распределение длины плода (хромосома Y) и общая ДНК, секвенированные из 7 образцов материнской плазмы.

Рис. 2.

Рис. 2.

Распределения длины плода (хромосома Y) и общей ДНК, секвенированные из 7 образцов материнской плазмы.

Мы заметили, что распределение размеров для хромосомы Y было смещено для большинства образцов в сторону более короткого конца по сравнению с другими хромосомами (рис. 2). Очень немногие последовательности Y хромосомы имели длину дихроматосомы. Кроме того, было немного больше последовательностей Y хромосомы с длиной короче, чем у монохроматосомы.Можно обогатить фракцию ДНК плода примерно в 1,5 раза за счет нацеливания на последовательности короче 150 п.н. (рис. 3).

Относительное увеличение или уменьшение фракции ДНК плода с 30 до 510 пар оснований с интервалом в 20 пар оснований.

Рис. 3.

Мы использовали локально взвешенную логистическую регрессию для визуализации тренда (сплошная линия). Каждый образец пациента представлен отдельным символом и сплошной линией разного цвета. Вертикальные пунктирные линии представляют собой пороговые значения размера, используемые для разделения считываний на 3 части с примерно равным количеством считываний.chrY, хромосома Y.

Рис. 3.

Относительное увеличение или уменьшение фракции ДНК плода с 30 до 510 пар оснований с интервалом в 20 пар оснований.

Мы использовали локально взвешенную логистическую регрессию для визуализации тренда (сплошная линия). Каждый образец пациента представлен отдельным символом и сплошной линией разного цвета. Вертикальные пунктирные линии представляют собой пороговые значения размера, используемые для разделения считываний на 3 части с примерно равным количеством считываний. chrY, хромосома Y.

ФРАКЦИЯ ФЕТАЛЬНОЙ ДНК И ОБНАРУЖЕНИЕ АНЕУПЛОИДИИ В РАЗНЫХ РАЗМЕРАХ ФРАКЦИЯХ

Поскольку последовательности Y хромосомы оказались короче (рис.2), мы исследовали, может ли отбор считываний с более короткой длиной увеличивать фракцию ДНК плода и улучшать обнаружение анеуплоидии. Мы разделили чтения на 3 группы по размеру: 30–150 п.н., 150–170 п.н. и 170–600 п.н. Каждая группа представляла примерно одну треть от общего числа парных чтений.

Процент ДНК плода был рассчитан для всех образцов из-за недопредставленности хромосомы X и / или чрезмерного представительства трисомных хромосом для всех считываний и для каждой размерной фракции после поправки на смещение GC (Таблица 1).Процент ДНК плода для фракции <150 п.н., как правило, был выше (примерно в 1,2–2 раза), чем общий процент ДНК плода (с учетом всех прочтений), тогда как для фракций> 150 п.н. Процент ДНК был ниже общего значения (рис. 3). Таким образом, отбор прочтений размером <150 п.н. позволил обогатить фракцию ДНК плода.

Распределение по размерам плодной и тотальной ДНК в материнской плазме и процентное содержание ДНК плода во фракциях разного размера.

Таблица 1.

Распределение по размерам плодной и тотальной ДНК в материнской плазме и процентное содержание плодной ДНК во фракциях разного размера.

909 9039 9039 9039 909 309 909 309 909 909 909 909 909 909 369 909 36

9036 —

Образец .	Кариотип .	Средняя длина, п.н. .		ДНК плода, оцененная по chrX,% .				ДНК плода, оцененная по трисомной хромосоме,% .
		Нежелезный a .	ChrY .	Все прочитано .	0–150 п.н. .	150–170 п.н. .	170–600 п.н. .	Все прочитано .	0–150 п.н. .	150–170 п.н. .	170–600 п.н. .
P48	46XY	164	163	6.64	5,72	4,00	8,28	—	—	—	—
P52	47XY + 21	161	21,46	32,08	14,58	15,16
P59	47XY + 18	165	162	42,20	46.90	36,88	38,34	42,34	52,48	41,54	34,72
P64	47XY + 13	164		15539	22,88	9,22	5,12
P73	46XY	159	148	24,72	37,46	14.38	12.20	—	—	—	—
P74	47XY + 21	164	159	11.44		159	16.44		16,52	16.20	10.16
P75	46XY	164	152	15.16	25.32	6.92	6,44	— 909 9036 936 936 9359	— 909 909
Образец .	Кариотип .	Средняя длина, п.н. .		ДНК плода, оцененная по chrX,% .				ДНК плода, оцененная по трисомной хромосоме,% .
		Нежелезный a .	ChrY .	Все прочитано .	0–150 п.н. .	150–170 п.н. .	170–600 п.н. .	Все прочитано .	0–150 п.н. .	150–170 п.н. .	170–600 п.н. .
P48	46XY	164	163	6,64	5,72	4,00	8,28	—	—	161	153	21.06	30,30	13,32	15,04	21,46	32,08	14,58	15,16
P59	47XY + 18	165 38236 909 909 369 369 909 369 909 462 369 909	42,34	52,48	41,54	34,72
P64	47XY + 13	164	155	6,78	13.08	2,68	2,76	12,72	22,88	9,22	5,12
P73	46XY	159	148	903 —	—	—
P74	47XY + 21	164	159	16,44	16,52	11,48	14.32	16,82	22,18	16.20	10,16
P75	46XY	164	152	15,16	25,32

Таблица 1.

Распределение по размерам плодной и тотальной ДНК в плазме матери и процентное содержание ДНК плода в фракциях разного размера.

909 369 909 36

9036 —

Образец .	Кариотип .	Средняя длина, п.н. .		ДНК плода, оцененная по chrX,% .				ДНК плода, оцененная по трисомной хромосоме,% .
		Нежелезный a .	ChrY .	Все прочитано .	0–150 п.н. .	150–170 п.н. .	170–600 п.н. .	Все прочитано .	0–150 п.н. .	150–170 п.н. .	170–600 п.н. .
P48	46XY	164	163	6,64	5,72	4,00	8,28	—	—	161	153	21.06	30,30	13,32	15,04	21,46	32,08	14,58	15,16
P59	47XY + 18	165 38236 909 909 369 369 909 369 909 462 369 909	42,34	52,48	41,54	34,72
P64	47XY + 13	164	155	6,78	13.08	2,68	2,76	12,72	22,88	9,22	5,12
P73	46XY	159	148	903 —	—	—
P74	47XY + 21	164	159	16,44	16,52	11,48	14.32	16,82	22,18	16.20	10,16
P75	46XY	164	152	15,16	25,32

909

9039 9039 409 409

409 409 409 409 409 409 409 409 423920

9

9 903

Образец .	Кариотип .	Средняя длина, п.н. .		ДНК плода, оцененная по chrX,% .				ДНК плода, оцененная по трисомной хромосоме,% .
		Нежелезный a .	ChrY .	Все прочитано .	0–150 п.н. .	150–170 п.н. .	170–600 п.н. .	Все прочитано .	0–150 п.н. .	150–170 п.н. .	170–600 п.н. .
P48	46XY	164	163	6,64	5,72	4,00	8,28	—	—	—	161	153	21,06	30,30	13,32	15,04	21,46	32,08	14,58	15,16
46,90	36,88	38,34	42,34	52,48	41,54	34,72
P64
P64	47XY + 13	47XY + 13	12,72	22,88	9,22	5,12
P73	46XY	159	148	24,72	37.46	14,38	12,20	—	—	—	—
P74	47XY + 21	164	159		164	159		164		16939	22,18	16,20	10,16
P75	46XY	164	152	15,16	25,32	6,92	6.44	—	—	—	—

Мы вычислили статистику z , меру, которая отражает уверенность в отклонении представления хромосомы от нормы. Поскольку статистика также зависит от количества рассматриваемых чтений, мы случайным образом выбрали треть от общего числа чтений в выборке для сравнения. Этот случайный выбор считываний имел размеры фрагментов, которые представляли общее распределение длин в бесклеточном образце ДНК.Хотя фракция плода и относительное число копий хромосомы были самыми высокими для фракции <150 п.н., что наблюдалось по увеличению отклонения относительного числа копий хромосомы X и трисомных хромосом от 1,0 (рис. 4A), величина Статистика z не всегда была самой высокой. В 4 из 7 случаев чувствительность была максимальной при использовании всех фракций (рис. 4B).

Число копий для каждой хромосомы относительно диплоидного состояния и уверенность в измерении представленности хромосом во фракциях разного размера.

Рис. 4.

(A), Число копий каждой хромосомы относительно диплоидного состояния во фракциях разного размера. Хромосома X (chrX) недостаточно представлена ​​для всех 7 беременностей у мужчин. Хромосомы 13, 18 и 21 чрезмерно представлены в соответствующих случаях трисомии 13, 18 и 21. Степень отклонения от типичного диплоидного представления обычно больше при анализе чтений <150 п.н., по сравнению со случайным выбором аналогичного числа чтений. от всех чтений, тогда как отклонение уменьшается с увеличением длины анализируемых чтений.(B), Уверенность в измерении представленности хромосом во фракциях разного размера. Горизонтальные пунктирные линии представляют уровень достоверности 99,99% (двусторонний) для обнаружения чрезмерного или недопредставления хромосом. В 4 из 7 случаев чувствительность наиболее высока, когда для анализа используются все фракции, хотя процент ДНК плода, как правило, выше во фракции размером <150 п.н.

Рис. 4.

Число копий для каждой хромосомы относительно диплоидного состояния и достоверность измерения репрезентативности хромосом во фракциях разного размера.

(A), Число копий каждой хромосомы относительно диплоидного состояния во фракциях разного размера. Хромосома X (chrX) недостаточно представлена ​​для всех 7 беременностей у мужчин. Хромосомы 13, 18 и 21 чрезмерно представлены в соответствующих случаях трисомии 13, 18 и 21. Степень отклонения от типичного диплоидного представления обычно больше при анализе чтений <150 п.н., по сравнению со случайным выбором аналогичного числа чтений. от всех чтений, тогда как отклонение уменьшается с увеличением длины анализируемых чтений.(B), Уверенность в измерении представленности хромосом во фракциях разного размера. Горизонтальные пунктирные линии представляют уровень достоверности 99,99% (двусторонний) для обнаружения чрезмерного или недопредставления хромосом. В 4 из 7 случаев чувствительность наиболее высока, когда для анализа используются все фракции, хотя процент ДНК плода, как правило, выше во фракции размером <150 п.н.

Обсуждение

Мы продемонстрировали прямое измерение распределения размеров ДНК матери и плода в плазме крови матери.В нескольких недавних исследованиях также использовалось традиционное секвенирование и пиросеквенирование 454 для изучения распределения размеров и профилей внеклеточной ДНК у здоровых людей и больных раком (16–18). Мы также попытались измерить распределение материнской бесклеточной ДНК по размеру с помощью пиросеквенирования 454 (3). Результаты этих исследований согласились с тем, что внеклеточная ДНК имеет размер пика 160–180 п.н. и что эта ДНК происходит в основном из апоптотических клеток. В этом исследовании мы использовали парное секвенирование на платформе Illumina, которая имеет гораздо более высокую пропускную способность, чем платформа 454, в отношении количества секвенированных чтений.Большое количество считываний позволило нам охарактеризовать распределение по размерам не только материнской ДНК, но и Y-последовательностей хромосомы, которые составляли лишь приблизительно 0,1% от всех последовательностей в образце ДНК материнской плазмы. Однако наш подход к секвенированию может измерять только распределение в диапазоне более низкой молекулярной массы, поскольку виды с более высокой молекулярной массой (> 1 т.п.н.) подвергаются истиранию при текущей подготовке образцов для секвенирования. Поскольку предыдущие эксперименты с ПЦР и гель-электрофорезом показали, что большая часть ДНК плода имеет размер <500 п.н., текущий подход к измерениям должен отражать распределение по размерам большей части ДНК плода.Мы отметили, что Саузерн-блоттинг ДНК материнской плазмы выявил присутствие ДНК размером> 20 т.п.н. (7). Будущие эксперименты с недавно разработанной техникой подготовки образцов парных пар, которая допускает размер вставки> 2 т.п.н. (19), должны дать подробную оценку размера частиц с более высокой молекулярной массой.

В нашем предыдущем исследовании оценки доли ДНК плода, полученные из данных секвенирования, варьировались от 8% до 40%, что выше, чем оценки из наших собственных измерений цифровой ПЦР перед секвенированием подготовки библиотеки и оценки <10%, наблюдаемые другие (20).Наши объяснения в то время состояли из двух компонентов: ( a ) Согласно исследованиям Li et al. (7) и Chan et al. (6) ДНК плода в материнской плазме короче, чем ДНК матери; и ( b ) наш метод секвенирования включал амплификации ПЦР с универсальными праймерами во время подготовки библиотеки и создания кластера. Известно, что ПЦР имеет более высокую эффективность для веществ с более низким молекулярным весом. Мы предположили, что увеличенная доля ДНК плода, измеренная на основе данных секвенирования, была артефактом метода секвенирования, который мы выбрали для использования.

В этом исследовании мы экспериментально подтвердили оба компонента нашего аргумента. Посредством секвенирования рестрикционного переваривания λ ДНК мы обнаружили, что виды с более низкой молекулярной массой были чрезмерно представлены. Кроме того, наши измерения секвенирования распределения по размерам материнской и плодной ДНК (рис.2) согласились с предыдущими выводами о том, что ДНК плода в основном короче 300 п.н., тогда как часть материнской ДНК имеет размер> 300 п.н. (6, 7 ). Эти наблюдения показали, что процесс секвенирования ДНК материнской плазмы с помощью платформы Illumina увеличил представление более коротких видов ДНК плода, тем самым увеличивая фракцию ДНК плода.

С момента открытия, что ДНК плода обычно короче материнской ДНК в материнской плазме, был разработан ряд методов для обогащения фракции ДНК плода путем отбора по размеру. Эти методы включают традиционный гель-электрофорез (7, 21), комбинации ПЦР-анализов с ампликонами разной длины (11) и разделение микрочипов (22). Поскольку предполагалось, что смещение длины считываний секвенирования дробовика происходит из-за ПЦР, можно было потенциально связать универсальные адаптеры с концами ДНК плазмы, а затем выполнить амплификацию ПЦР против универсальных последовательностей для обогащения фракции ДНК плода.При использовании этих двух подходов важно, чтобы ДНК плазмы не была фрагментирована распылением или обработкой ультразвуком, чтобы можно было сохранить исходное распределение ДНК по размерам.

Чувствительность обнаружения анеуплоидии плода путем подсчета отдельных молекул ДНК зависит как от фракции ДНК плода, так и от количества подсчитанных молекул. Анеуплоидия более уверенно выявляется, если фракция ДНК плода высока и подсчитывается большое количество молекул. Наши результаты показывают, что хотя доля ДНК плода увеличивается в самых коротких фрагментах (рис.4A), тот факт, что общее количество подсчитываемых молекул меньше, отрицательно влияет на достоверность обнаружения (рис. 4B). Следовательно, «информативное» обогащение длинных фрагментов путем цифрового выбора размера в образцах, таких как образцы, собранные на ранних сроках беременности, когда фракция ДНК плода, как правило, низкая, будь то парное секвенирование или цифровая ПЦР (11, 23), может не дать результата. любое заметное повышение чувствительности обнаружения анеуплоидии и его следует использовать с осторожностью. Возможность повышения чувствительности при обнаружении анеуплоидии зависит от исходной фракции ДНК плода, величины увеличения фракции ДНК плода, полученной путем выбора размера, и количества молекул, оставшихся после выбора размера.Одна ситуация, в которой мы можем представить себе цифровой выбор размера весьма полезным, — это когда образцы были получены неоптимально. Например, если обработка образцов крови задерживается, материнские лимфоциты лизируют и искусственно уменьшают фракцию плода, загрязняя образец более длинными фрагментами материнской геномной ДНК. Эти более длинные фрагменты потенциально можно исключить без уменьшения количества фрагментов плода, используемых в анализе.

В заключение мы показали, что парное секвенирование позволяет напрямую измерять распределение длины внеклеточной ДНК плода в материнской плазме с разрешением по одному основанию.Процесс секвенирования Illumina внес смещение в распределение длины секвенированного образца, что увеличило представление ДНК плода. Выбор секвенированных считываний длиной <150 п.н. может дополнительно увеличить фракцию ДНК плода, но не обязательно повысит чувствительность обнаружения анеуплоидии путем подсчета одиночных молекул. Мы предполагаем, что быстрый прогресс в области секвенирования и связанных с ним технологий позволит реализовать множество новых методов исследования бесклеточных нуклеиновых кислот не только для пренатальной диагностики, но и для ранней диагностики рака.

Благодарности

Мы благодарим Отделение перинатальной генетики и Центр общих клинических исследований Стэнфордского университета за набор пациентов. Мы также благодарим Норму Нефф за ее помощь в проведении экспериментов по секвенированию.

Список литературы

1.

Американский колледж акушеров и гинекологов

.

Практический бюллетень ACOG № 88, декабрь 2007 г. Инвазивное пренатальное тестирование на анеуплоидию

.

Акушерский гинекол

2007

;

110

:

1459

—

67

.2.

Деннис

Lo YM

,

Chiu

RW

.

Пренатальная диагностика: прогрессирование по нуклеиновым кислотам плазмы

.

Nat Rev Genet

2007

;

8

:

71

—

7

.3.

Вентилятор

HC

,

Блюменфельд

YJ

,

Читкара

U

,

Hudgins

L

,

Quake

SR

.

Неинвазивная диагностика анеуплоидии плода методом дробового секвенирования ДНК материнской крови

.

Proc Nat Acad Sci U S A

2008

;

105

:

16266

—

71

.4.

Chiu

RW

,

Chan

KC

,

Gao

Y

,

Lau

VY

,

Zheng

W

,

Leung

и др.

Неинвазивная пренатальная диагностика хромосомной анеуплоидии плода путем массового параллельного геномного секвенирования ДНК в плазме крови матери

.

Proc Nat Acad Sci U S A

2008

;

105

:

20458

—

63

. 5.

Chiu

RW

,

Sun

H

,

Akolekar

R

,

Clouser

C

,

Lee

C

,

McKernan K

и др.

Анализ ДНК материнской плазмы с массовым параллельным секвенированием лигированием для неинвазивной пренатальной диагностики трисомии 21

.

Clin Chem

2010

;

56

:

459

—

63

.6.

Chan

KC

,

Zhang

J

,

Hui

AB

,

Wong

N

,

Lau

TK

,

Leung

TN

и др.

Распределение по размерам материнской и плодной ДНК в материнской плазме

.

Clin Chem

2004

;

50

:

88

—

92

.7.

Li

Y

,

Zimmermann

B

,

Rusterholz

C

,

Kang

A

,

Holzgreve

W

,

Hahn

.

Разделение по размеру циркуляторной ДНК в материнской плазме позволяет легко обнаруживать полиморфизмы ДНК плода

.

Clin Chem

2004

;

50

:

1002

—

11

.8.

Li

Y

,

Di

Naro E

,

Vitucci

A

,

Grill

S

,

Zhong

XY

,

Holzgreve

, 9000 S

Размерное фракционирование внеклеточной ДНК в материнской плазме улучшает обнаружение отцовской точечной мутации бета-талассемии с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF

.

Диагностика плода Тер

2009

;

25

:

246

—

9

.9.

Li

Y

,

Holzgreve

W

,

Page-Christiaens

GC

,

Gille

JJ

,

Hahn

S

.

Улучшенное пренатальное выявление точечной мутации плода для ахондроплазии за счет использования фракционированной по размеру циркуляторной ДНК в плазме крови матери — клинический случай

.

Prenat Diagn

2004

;

24

:

896

—

8

.10.

Li

Y

,

Wenzel

F

,

Holzgreve

W

,

Hahn

S

.

Генотипирование унаследованных от отца SNP плода методом MALDI-TOF MS с использованием внеклеточной ДНК плода в плазме матери: влияние фракционирования по размеру

.

Электрофорез

2006

;

27

:

3889

—

96

. 11.

Lun

FM

,

Tsui

NB

,

Chan

KC

,

Leung

TY

,

Lau

TK

et al.,

0002 Charoenkwan P

Неинвазивная пренатальная диагностика моногенных заболеваний с помощью цифрового отбора по размеру и относительной дозы мутации ДНК в плазме матери

.

Proc Natl Acad Sci U S A

2008

;

105

:

19920

—

5

.12.

Sikora

A

,

Zimmermann

BG

,

Rusterholz

C

,

Birri

D

,

Kolla

V

,

и др.

Lapaire

Обнаружение повышенного количества внеклеточной ДНК плода с помощью коротких ампликонов ПЦР

.

Clin Chem

2009

;

56

:

136

—

8

.13.

Kozarewa

I

,

Ning

Z

,

Quail

MA

,

Sanders

MJ

,

Berriman

M

,

Turner

Подготовка библиотеки секвенирования Illumina без амплификации облегчает улучшенное картирование и сборку (G + C) -сбалансированных геномов

.

Nat Methods

2009

;

6

:

291

—

5

. 14.

Белый

RA

3rd,

Blainey

PC

,

Fan

HC

,

Quake

SR

.

Цифровая ПЦР обеспечивает чувствительную и абсолютную калибровку для высокопроизводительного секвенирования

.

BMC Genomics

2009

;

10

:

116

.15.

Вентилятор

HC

,

Quake

SR

.

Чувствительность неинвазивного пренатального обнаружения анеуплоидии плода из материнской плазмы с помощью дробовидного секвенирования ограничена только статистикой подсчета

.

PLoS ONE

2010

;

5

:

e10439

.16.

van der Vaart

M

,

Semenov

DV

,

Kuligina

EV

,

Richter

VA

,

Pretorius

PJ

.

Характеристика циркулирующей ДНК путем секвенирования с параллельными метками на платформе 454

.

Clin Chim Acta

2009

;

409

:

21

—

7

. 17.

Suzuki

N

,

Kamataki

A

,

Yamaki

J

,

Homma

Y

.

Характеристика циркулирующей ДНК в плазме здорового человека

.

Clin Chim Acta

2008

;

387

:

55

—

8

. 18.

Beck

J

,

Urnovitz

HB

,

Riggert

J

,

Clerici

M

,

Schutz

E

.

Профиль циркулирующей ДНК у практически здоровых людей

.

Clin Chem

2009

;

55

:

730

—

8

.19.

Bentley

DR

,

Balasubramanian

S

,

Swerdlow

HP

,

Smith

GP

,

Milton

J

,

Brown CG

и др.

Точное секвенирование всего генома человека с использованием химии обратимых терминаторов

.

Nature

2008

;

456

:

53

—

9

.20.

Lo

YM

,

Tein

MS

,

Lau

TK

,

Haines

CJ

,

Leung

TN

,

Poon

PM

и др.

Количественный анализ ДНК плода в плазме и сыворотке матери: значение для неинвазивной пренатальной диагностики

.

Am J Hum Genet

1998

;

62

:

768

—

75

. 21.

Хорхес

CJ

,

Bischoff

FZ

.

Улучшение обогащения циркулирующей ДНК плода для генетического тестирования: фракционирование по размеру с последующей амплификацией целого гена

.

Диагностика плода Тер

2009

;

25

:

314

—

9

.22.

Hahn

T

,

Drese

KS

,

O’Sullivan

CK

.

Микросистема для выделения ДНК плода из материнской плазмы путем препаративного разделения по размеру

.

Clin Chem

2009

;

55

:

2144

—

52

. 23.

Вентилятор

HC

,

Quake

SR

изобретатели.

Метод характеристики одиночных молекул ДНК по длине

..

© 2010 Американская ассоциация клинической химии

.