Обезглавливание — это процедура эвтаназии мелких животных, таких как крысы и птицы. Это достигается путем быстрого перерезания шеи животного вплотную к голове с помощью гильотины с острым лезвием. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет получить ткани и жидкости головного мозга, которые не загрязнены химическими веществами, такими как газы и анестетики, и не подвержены влиянию электрического тока. Однако метод не свободен от противоречий и до сих пор не принят в качестве приемлемой гуманной процедуры эвтаназии [1]. Это так, хотя большинство исследователей приходят к выводу, что обезглавливание не является бесчеловечным приемом [2], [3], [4]. Однако меньшинство авторов утверждает, что обезглавливание может вызывать у животных страдания и боль [5]. Противоречие в основном вызвано неопределенной интерпретацией мозговой активности, наблюдаемой с момента перерезания шеи до того момента, когда ЭЭГ становится изоэлектрической, что указывает на глубокое бессознательное состояние. Длительность до изоэлектричества ЭЭГ варьирует от нескольких секунд [3] до 14 секунд [5], это расхождение значительное. Учитывая дебаты по этому вопросу, нет единого мнения о признании обезглавливания в качестве адекватного метода эвтаназии в комитетах по этике животных в Нидерландах, перед которыми стоит задача рассмотреть вопрос о том, разрешены ли эксперименты на животных. Вопрос о том, как долго сохраняется сознание после перерезания шеи, важен для оценки гуманности и приемлемости обезглавливания.

Настоящий эксперимент был предпринят для детального анализа характеристик ЭЭГ после обезглавливания крыс. Группу бодрствующих, находящихся в сознании крыс обезглавливали, а ЭЭГ записывали до, во время и после перерезания шеи. Для облегчения интерпретации ЭЭГ с точки зрения сознания вторую группу крыс декапитировали под наркозом. Перед обезглавливанием этих крыс анестезировали, чтобы выяснить, какой вид активности может присутствовать на ЭЭГ, не указывая на форму сознания. Этот план сознательной анестезии позволил сравнить характеристики ЭЭГ крыс в сознании и без сознания, в частности, в отношении критического периода между моментом декапитации и полным исчезновением активности ЭЭГ.

Разрешение на проведение эксперимента было получено от Комитета по этике животных Университета Радбауд в Неймегене под номером RU-DEC 2007-170. Объектами эксперимента служили 22 крысы-самцы Вистар в возрасте от 6 до 8 месяцев с массой тела от 230 до 290 г, полученные в предыдущем электрофизиологическом эксперименте (RU DEC 2007-034). Все они уже были снабжены набором постоянных трехполюсных электродов. Два электрода наводили на лобную и теменную кору, заземляющий электрод располагали над мозжечком.

Обезглавливание проводилось в двух экспериментальных условиях. В первом состоянии (n = 9) крысы находились в полном сознании, а во втором состоянии (n = 8) крысы находились под изофлурановым наркозом в дозе, обычно используемой для операционных целей. Эксперимент начался с 22 крыс, но 5 крыс потеряли набор электродов во время эксперимента.

Крыс обездвижил опытный зоотехник, поместил их голову в отверстие гильотины и подключил кабель ЭЭГ. Базовую ЭЭГ записывали в течение 30 секунд. После этого животных быстро обезглавливали. Гильотину построила Механическая мастерская факультета социальных наук. Он состоял из металлического каркаса и острого лезвия, которым можно было управлять одной рукой. Во время декапитации во время наблюдения за животными регистрировали ЭЭГ. Запись ЭЭГ продолжалась не менее 5 минут после декапитации.

ЭЭГ были зарегистрированы в диапазоне частот 0,1–100 Гц с режекторным фильтром 50 Гц, оцифрованы с частотой дискретизации 512 Гц с помощью системы Windaq (www.dataq.com) и сохранены для автономного анализа. .

После обезглавливания всех крыс анатомически исследовали для определения точной плоскости разреза. Этот раздел был нацелен на атланто-затылочный сустав, чтобы заблокировать как можно больше сенсорных входов в мозг [2]. Все животные, кроме трех, имели правильный разрез позвоночника. У этих трех животных разрез имел расстояние более одного позвонка до атланто-затылочного сустава. Однако данные этих крыс нельзя было отличить от данных с правильным разрезом, и они были объединены с правильно обезглавленными животными.

Анализ ЭЭГ был выполнен с помощью Brain Vision Analyzer (www.brainproducts.com). Записи ЭЭГ были сегментированы по эпохам в 1,0 секунды со скользящим окном 0,5 секунды. В эти эпохи БПФ выполнялся с нижней границей 1,0 Гц и верхней границей 100 Гц, оба с 48 дБ/окт. Односекундные эпохи непосредственно перед и после артефакта обезглавливания игнорировались. Результатом БПФ была плотность напряжения (В/Гц), которую называют мощностью ЭЭГ. GraphPad Prism 5.03 (www.graphpad.com) использовали для определения динамики мощности ЭЭГ во времени. Статистический анализ проводили в SSPS 15.0 (www.spss.com).

Нижняя кривая показывает пример ЭЭГ крысы из бодрствующей группы, записанной непосредственно перед (т.е. исходным уровнем), во время и после декапитации. Базовые ЭЭГ этих крыс полностью репрезентативны для бодрствующих животных. После декапитации видна низкоамплитудная ЭЭГ, наложенная на большую волну, предположительно артефакт лезвия гильотины. У всех животных эта низкоамплитудная активность ЭЭГ чередуется с повторяющимися более мелкими артефактами, совпадающими с жевательными движениями рта животного. Эти движения имеют частоту около 1 Гц и длятся около 15 секунд. При наблюдении за обезглавленным телом крыс видны повторяющиеся синхронные подергивания задних лап, длящиеся около одной минуты.

Открыть в отдельном окне

ЭЭГ крыс после декапитации.

Примеры ЭЭГ крыс, записанных за период от 10 секунд до и до 30 секунд после обезглавливания. Полоса пропускания 0,1–100 Гц. Нижний след бодрствующей крысы, верхний след крысы под наркозом. Обратите внимание на большой артефакт гильотины и артефакты, совпадающие с жевательными движениями рта.

Верхняя кривая показывает ЭЭГ крысы из группы анестезии. Исходная ЭЭГ этих крыс показывает типичный анестезиологический паттерн подавления вспышек. После артефакта гильотины на этих ЭЭГ также наблюдаются жевательные движения. Также наблюдается подергивание ног.

Выполнено БПФ сигналов ЭЭГ. приведены усредненные спектрограммы исходных периодов и 4 моментов времени после декапитации (2,5; 5; 11 и 17 с). Наблюдается зависящее от времени снижение мощности. Количественная оценка этой временной зависимости показана на рис.

Открыть в отдельном окне

Спектрограммы ЭЭГ после декапитации.

Средние спектрограммы ЭЭГ для исходного периода, т. е. за 10 секунд до декапитации, и для 5 временных точек после декапитации. Данные указаны в вольтах, даны групповые средние значения. К необработанному среднему спектру применялось сглаживание 2-го порядка с 4 соседями. По оси абсцисс данные около 50 Гц удалены из-за режекторного фильтра. Обратите внимание на логарифмическую шкалу ординаты. В анестезии перед декапитацией ЭЭГ имеет большую мощность, отражающую всплески в паттерне подавления всплесков. После обезглавливания в обеих группах наблюдается быстрое и глобальное снижение силы. Количественная оценка этого распада показана на рис.

Открыть в отдельном окне

Временная зависимость мощности ЭЭГ после декапитации.

Временная зависимость средней мощности ЭЭГ от 1 до 100 Гц (а) и от 13 до 100 Гц (б). Синие открытые символы для бодрствующей группы, красные символы для наркозной группы. В преддекапитационной ЭЭГ бодрствующих животных мощность увеличивается на 30% в течение последних 10 секунд. Мощность преддекапитационного периода для анестезированной группы указана для всплеска (красные закрытые символы, высокая мощность), а также для частей подавления (красные открытые символы, низкая мощность). Сила всех крыс резко снижается после декапитации. Экспоненциальная функция затухания описывает это зависящее от времени уменьшение. Для обеих групп время полураспада составило 5,5 секунды для диапазона 1–100 Гц и 3,7 секунды для диапазона 13–100 Гц.

представлена ​​временная зависимость средней мощности ЭЭГ от 1 до 100 Гц у всех крыс обеих групп (45–55 Гц исключены из-за режекторного фильтра). В фоновой ЭЭГ бодрствующих животных мощность увеличивается на 30% в течение последних 10 секунд перед декапитацией, достигая 4,0 (0,3) В/Гц (подобранное значение с SE подгонки). В анестезированной группе мощность базового периода оценивается как для вспышек, так и для частей подавления. Подавляющая часть имеет очень низкую мощность, тогда как мощность во время вспышек, как и ожидалось, довольно высокая.

Мощность ЭЭГ всех крыс после декапитации резко снижается. К этим данным после обезглавливания была подогнана экспоненциальная функция затухания с начальным значением подобранного значения до обезглавливания. Для данных бодрствующей группы и группы под анестезией независимые подборы сравнивали с глобальным подбором, который разделял скорость затухания. Независимые подгонки существенно не отличались (p = 0,5), поэтому предпочтительной была глобальная подгонка: за 5,5 с мощность снизилась до 50% от уровня начального значения, при 95% доверительный интервал между 5,0 и 6,1 с. Таким образом, мощность ЭЭГ после обезглавливания в группе под наркозом почти такая же, как и в группе бодрствования.

показывает мощность ЭЭГ в диапазоне от 13 до 100 Гц. Сила в этой полосе признается выражением бдительности и способности испытывать сенсорные восприятия, включая боль, тогда как отсутствие активности в этой полосе интерпретируется как недвусмысленная потеря чувствительности [6], [7], [8]. Мощность постдекапитационной ЭЭГ в этом когнитивном диапазоне имеет временную динамику, сравнимую с мощностью в диапазоне 1–100 Гц, но время до полураспада короче: 3,7 с при частоте 95% доверительный интервал от 3,5 до 4,1 секунды (значительно отличается от предыдущих 5,5 секунд, t(2)  = 173, p<0,001).

показаны длинные записи ЭЭГ всех животных эксперимента. Через относительно долгое время после декапитации, когда ЭЭГ полностью достигла изоэлектричества, определяемого как оставшееся не более 10% мощности, у всех крыс наблюдается медленная положительно-отрицательно-положительная волна большой амплитуды. Латентный период этой волны после декапитации в бодрствующей группе составляет 52±7 секунд, в наркозной группе 85±6 секунд.

Открыть в отдельном окне

Все ЭЭГ до 120 секунд после обезглавливания.

Все ЭЭГ, записанные за период от 10 секунд до и до 120 секунд после обезглавливания. Полоса пропускания 0,1–100 Гц. Нижняя панель бодрствующих животных, верхняя панель под наркозом. Обратите внимание на большую медленную волну примерно через 50 секунд после обезглавливания для бодрствующих животных и примерно через 80 секунд для группы под наркозом.

Хотя ЭЭГ до и после волны является изоэлектрической, визуально и в соответствии с определением 10%, увеличение кривой ЭЭГ непосредственно перед и после этой волны показывает разницу в амплитуде ЭЭГ (см. ) . Анализ БПФ () действительно показал значительную разницу в мощности во всех диапазонах частот. Показана полоса 1–100: в двухфакторном дисперсионном анализе, объединяющем 20 односекундных эпох, с группой как между фактором и пред-постволной как внутри фактора, была обнаружена очень значительная разница до-постволны F(1,15 )  = 42, p<0,0001).

Открыть в отдельном окне

ЭЭГ вокруг волны.

Примеры ЭЭГ крыс, записанных за период от 30 секунд до волны до 30 секунд после волны. Полоса пропускания 0,1–100 Гц. Нижний след бодрствующей крысы, верхний след крысы под наркозом. Обратите внимание на масштаб ординаты. Эта ЭЭГ считается изоэлектрической, но мощность после волны ниже, чем до волны.

Открыть в отдельном окне

Мощность ЭЭГ вокруг волны.

Средняя мощность ЭЭГ в диапазоне от 1 до 100 Гц вокруг волны. Синие открытые символы для бодрствующей группы, красные закрытые символы для наркозной группы. В послеволновой ЭЭГ мощность ниже, чем в предволновой ЭЭГ.

Критический момент для оценки обезглавливания как гуманного метода эвтаназии животных — это время, которое требуется после обезглавливания, чтобы животные полностью потеряли сознание, неспособные воспринимать страдания и боль. Целью данного исследования было найти ответ в ЭЭГ.

У бодрствующих крыс это длится около 17 секунд, прежде чем мощность ЭЭГ станет изоэлектрической. Поскольку неизвестно, как мощность ЭЭГ коррелирует с уровнем сознания, у субъектов, не принимающих наркотики, изоэлектричество формирует прочную основу для того, чтобы считать животное полностью бессознательным. Однако возникает вопрос, является ли степень сознания в более раннее время уже настолько низкой, что восприятие боли и страдания уже полностью устранено.

В литературе нелегко найти данные о связи ЭЭГ мощность — сознание у нелекарственных лиц. Сообщения об этой связи имеются либо у пациентов с поврежденным мозгом, например, у пациентов в коме [9] или во время фармакологически индуцированной потери сознания, такой как анестезия [10]. Поэтому для настоящего обсуждения из нашей базы данных были взяты ЭЭГ бодрствующих и спящих крыс, и мощность этих ЭЭГ сравнивалась, чтобы получить представление о том, как мощность ЭЭГ сна, когда сознание почти отсутствует, связана с ЭЭГ бодрствования, когда сознание находится на высоком уровне. Хорошо известно, что форма спектрограмм этих двух состояний различается [11]; мощность на низких частотах (1–12 Гц) во время сна намного выше, чем в бодрствующем состоянии (200%, SEM 21%, n = 8 крыс, 10 секунд на животное). Для настоящего вопроса важно, что мощность в когнитивном диапазоне (13–100 Гц) в состоянии сна по-прежнему составляет 78% (SEM 4,4%) от мощности во время бодрствования. Поскольку сон не является глубоко бессознательным, представляется целесообразным принять более низкое значение, таким образом предполагая, что животные находятся в бессознательном состоянии при снижении мощности когнитивного диапазона на 50%. Эта точка достигается за 3,7 секунды.

ЭЭГ субъекта под наркозом сильно отличается от ЭЭГ человека без лекарств. Поэтому весьма удивительно, что ЭЭГ после обезглавливания и ее мощность в группе под наркозом почти такие же, как и в группе в бодрствующем состоянии. Одна из интерпретаций заключается в том, что результирующая мощность ЭЭГ у бодрствующих животных не совсем точно указывает на сознание и дистресс, поскольку такая же активность присутствует в ЭЭГ бессознательных анестезированных животных. С другой стороны, сходство мощности ЭЭГ после обезглавливания в обеих группах может также означать, что сознание животного кратковременно улучшается сразу после разреза шеи. Интерпретация может заключаться в том, что порез является настолько мощным возбуждающим стимулом, что даже анестезированные животные приходят в сознание. Это утверждение подтверждается наблюдением, что корреляционная размерность ЭЭГ, мера сознания, резко возрастает, когда животному в глубокой анестезии дается болевой стимул [12].

Представленные здесь результаты позволяют сделать вывод о том, что обезглавливание приводит к быстрой потере сознания, поэтому можно с уверенностью предположить, что через 3–4 секунды после обезглавливания животное теряет сознание, не способное воспринимать стресс и боль. Это число хорошо согласуется с результатами Дерра [3]: 2,7 секунды и Холсона [4]; 3–6 секунд. Можно сделать вывод, что обезглавливание не является бесчеловечным методом эвтаназии мелких животных. Этот вывод, однако, не означает, что обезглавливание рекомендуется во всех ситуациях. Это наступательный метод, который имеет эстетический недостаток: выполнение и соблюдение этого приема вызывает недовольство. Более того, для обезглавливания требуется опытный и квалифицированный персонал.

Замечательным и последовательным результатом является появление очень медленной, большой, поздней волны на ЭЭГ. Через относительно продолжительное время после перерезания шеи, когда изоэлектричество уже присутствует в ЭЭГ в течение значительного времени, примерно через 50 с после декапитации крыс бодрствующей группы следует крупноамплитудная положительно-отрицательно-положительная волна. У наркотизированных крыс эта волна также присутствует, но появляется позже, примерно через 80 секунд после разреза шеи. Внимательно изучив кривую ЭЭГ непосредственно перед и после этой волны, можно было увидеть, что амплитуда ЭЭГ выше, чем до волны, чем после волны; это было подтверждено анализом БПФ. Положительная-отрицательная-положительная форма волны, вероятно, вызвана фильтром верхних частот 0,1 Гц. Возможно, исходная волна имеет форму сигмовидной формы, как описано Бурешом и Бурешовой [13]. Здесь предполагается, что из-за нехватки энергии для поддержания этого потенциала нейроны в это время теряют свой мембранный потенциал. Таким образом, волна может отражать массивное открытие ионных каналов: волну деполяризации. Все еще функционирующие эти ионные каналы в период перед волной могут быть ответственны за наблюдаемую разницу в мощности ЭЭГ до и после волны. Следовательно, считается, что волна представляет собой синхронную гибель нейронов головного мозга, выраженную в «волне смерти».

В группе под анестезией эта волна задерживается, возможно, из-за защитного характера анестетиков. Такую волну можно наблюдать и в ЭЭГ крыс, усыпленных передозировкой пентобарбитала (см. два примера). В недавней работе Лахмира с коллегами [14] ЭЭГ пациентов регистрировалась в виде биспектрального индексного монитора (БИС) во время их умирания. У всех пациентов они могли зарегистрировать большую волну перед смертью, которую они интерпретировали как связанную с потерей потенциалов клеточных мембран. Возможно, эта волна имеет некоторые аналогии с «волной смерти», хотя по частотным характеристикам отличается от волны, описываемой в настоящем эксперименте.

Открыть в отдельном окне

ЭЭГ двух животных, усыпленных передозировкой пентобарбитала.

ЭЭГ двух животных, умерщвленных в результате передозировки пентобарбитала. Указано время после инъекции 120 мг/кг. ЭЭГ до излома оси абсцисс представляет собой типичный паттерн подавления всплесков. Через значительное время после последнего всплеска наблюдается большая волна. Обратите внимание на большую разницу во времени задержки после инъекции и после последней вспышки.

Из этой экспериментальной работы сделан вывод, что сознание может исчезнуть в течение нескольких секунд после обезглавливания. Таким образом, подразумевается, что обезглавливание является быстрым и негуманным методом эвтаназии. Интересно, что нейронам требуется почти одна минута, чтобы потерять свой мембранный потенциал. Ввиду этого вывода длительный мониторинг ЭЭГ во время процесса естественного умирания и фундаментальные исследования физиологии функционирования мозга во время этого процесса могли бы дать информацию в продолжающейся дискуссии об определении смерти мозга, но здесь предполагается, что массовая волна, которая может быть зарегистрирована примерно через одну минуту после обезглавливания, в конечном итоге отражает смерть мозга.

Сердечно благодарим Gerard van Ooijen за незаменимую электротехническую помощь и Drs. Яну Питеру Цварту, магистру наук, за критическое прочтение рукописи и полезные советы.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Финансирование: У этих авторов нет поддержки или финансирования для отчета.

1. Оллред Дж.Б., Бернтсон Г.Г. Эвтаназия крыс путем обезглавливания негуманна? Дж Нутр. 1986; 116: 1859–1861. [PubMed] [Академия Google]

2. Vanderwolf CH, Buzsaki G, Cain DP, Cooley RK, Robertson B. Электрическая активность неокортекса и гиппокампа после обезглавливания крысы. Исследования мозга. 1988; 451:340–344. [PubMed] [Google Scholar]

3. Дерр РФ. Восприятие боли в декапитированном мозге крысы. Естественные науки. 1991; 49: 1399–1402. [PubMed] [Google Scholar]

4. Холсон Р.Р. Эвтаназия путем обезглавливания: свидетельство того, что этот метод вызывает быструю и безболезненную потерю сознания у лабораторных грызунов. Нейротоксикология и тератология. 1992;14:253–257. [PubMed] [Google Scholar]

5. Микеска Дж.А., Клемм В.Р. ЭЭГ-оценка гуманности асфиксии и декапитационной эвтаназии лабораторной крысы. Лаборатория анимационных наук. 1975; 25: 175–179. [PubMed] [Google Scholar]

6. Хьюз Дж. Р., Рой Джон Э. Обычная и количественная электроэнцефалография в психиатрии. Журнал нейропсихиатрии и клинических нейронаук. 1999; 11: 190–208. [PubMed] [Google Scholar]

7. Raj ABM, O’Callaghan M. Влияние количества и частоты токов оглушения только головы на электроэнцефалограмму и соматосенсорные вызванные потенциалы у бройлеров. Забота о животных. 2004;13:159–170. [Google Scholar]

8. Prinz S, Van Oijen G, Ehinger F, Bessei W, Coenen A. Влияние оглушения водяной баней на электроэнцефалограммы и физические рефлексы бройлеров с использованием импульсного постоянного тока. Poult Sci. 2010; 89: 1275–1284. [PubMed] [Google Scholar]

9. Auyong DB, Klein SM, Gan TJ, Roche AM, Olson D, et al. Обработанная электроэнцефалограмма во время донорства после сердечной смерти. Анестезия и обезболивание. 2010; 110:1428–1432. [PubMed] [Google Scholar]

10. Voss L, Sleigh J. Мониторинг сознания: текущее состояние мониторов глубины анестезии на основе ЭЭГ. Best Pract Res Clin Anaesthesiol. 2007; 21: 313–325. [PubMed] [Академия Google]

11. Коэнен А.М. Нейронная активность, лежащая в основе электроэнцефалограммы и вызванных потенциалов сна и бодрствования: значение для обработки информации, Review Neurosci Biobehav Rev. 1995; 19: 447–463. [PubMed] [Google Scholar]

12. Van den Broek PLC, van Rijn CM, van Egmond J, Coenen AML, Booij LHDJ. Размер эффективной корреляции и коэффициент подавления импульсов ЭЭГ у крыс. Корреляция с индуцированной севофлураном глубиной анестезии. Eur J Анестезиология. 2006;23:391–402. [PubMed] [Google Scholar]

13. Буреш Дж., Бурешова О. Терминал деполяризации аноксии как индикатор уязвимости большого скопления аноксии и ишемии.