Внеклеточный Ca2+ — Carlson Lab

Пояснение к нашей публикации 2017 года в PLoS One:

Потребность во внеклеточном Ca2+ для оплодотворения у африканской когтистой лягушки Xenopus laevis вызвала споры. Во-первых, среди физиологов спермы было широко признано, что проникновение Ca2+ в мужские гаметы необходимо для акросомной реакции в сперматозоидах почти всех видов, включая X. laevis . Однако исследование 1998 года, проведенное Wilkinson et al., показало, что яйца, осемененные в присутствии 5 мМ хелатора Ca2+ BAPTA, оплодотворяются и инициируют нормальное эмбриональное развитие. BAPTA имеет очень высокое сродство к Ca2+ с Kd 110 нМ. В сочетании со знанием того, что в исследовании Уилкинсона для проведения своих экспериментов использовались стандартные растворы для оплодотворения (содержащие менее 1 мМ добавленного CaCl2), вокруг не должно быть никакого Ca2+, который мог бы проникнуть в сперму и сигнализировать об акросомной реакции в присутствии 5 мМ BAPTA.

. Сообщаемая способность сперматозоидов оплодотворять яйцеклетки в присутствии 5 мМ BAPTA вызвала наш интерес. Итак, мы стремились выяснить, требуется ли внеклеточный Ca2+ для оплодотворения X. laevis. Если требуется внеклеточный Ca2+, то когда?

Чтобы начать эти эксперименты, мы просто спросили, происходит ли оплодотворение и раннее эмбриональное развитие X. laevis в отсутствие добавленного CaCl2. Для этих экспериментов мы использовали появление борозд дробления как показатель эмбрионального развития:

Мы обнаружили, что X. laevis  яйца, осемененные в растворе без добавления двухвалентных катионов (без CaCl2 или MgCl2), развивались нормально:

Эти результаты были неожиданными в контексте требования о поступлении Ca2+ для акросомной реакции, но согласовывались с рукописью Викинсона. Итак, мы продолжили наши эксперименты, экспериментально определив, нормально ли протекает раннее эмбриональное развитие в присутствии различных концентраций BAPTA:

Мы обнаружили меньше борозд дробления в яйцах, осемененных при более высоких концентрациях BAPTA. Сопоставляя эти данные с сигмоидальной функцией, мы рассчитали среднюю полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC50), равную 519± 76 мкМ. Этот результат был для нас неожиданным по двум причинам: во-первых, мы обнаружили, что BAPTA предотвращает раннее эмбриональное развитие — полная противоположность результатам, описанным в рукописи Уилкинсона; Во-вторых, обнаруженная нами IC50 (519 мкМ) была НАМНОГО выше, чем Kd BAPTA для Ca2+. В связи с этим последним открытием мы были обеспокоены тем, что BAPTA мешает эмбриональному развитию неспецифическими действиями, независимыми от хелирования Ca2+. Таким образом, мы проверили возможные неспецифические эффекты двумя способами. Сначала мы хелатировали Ca2+ другим соединением, EGTA: 9.0003

Опять же, мы обнаружили меньше борозд дробления в яйцах, осемененных при более высоких концентрациях ЭГТА, со средним значением IC50 178 ± 25 мкМ (, чтобы прервать эту историю на мгновение: вы, возможно, слышали, что BAPTA является лучшим доступным хелатором Ca2+ и интересно, почему EGTA, по-видимому, более эффективна для этих экспериментов, оказывая полумаксимальный эффект при более низкой концентрации. Ответ заключается в том, что EGTA связывается с Ca2+ с более высоким сродством, чем BAPTA, с Kd около 10 нМ при pH 7,8. Причина почему BAPTA лучше, чем EGTA, просто потому, что его сродство к Ca2+ не зависит от pH. BAPTA был основан на EGTA — и оба они были первоначально синтезированы Роджером Циеном и его коллегами на основе EDTA… который связывает как Ca2+, так и Mg2+ с относительно высоким сродством, что делает его непригодным для наших экспериментов. Кроме того, распространено заблуждение, что каждая молекула BAPTA связывает два иона Ca2+; в оригинальной рукописи BAPTA Роджер Цзянь убедительно демонстрирует с помощью ЯМР, что каждая молекула BAPTA связывается только с ОДНИМ ионом Ca2+ ).

В качестве второго подхода мы определили, можем ли мы восстановить вызванное BAPTA нарушение раннего эмбрионального развития путем осеменения в BAPTA и насыщения концентраций Ca2+. Для этих экспериментов мы осеяли 1 мМ BAPTA (концентрация, которая полностью предотвращала развитие эмбриона в наших руках) и различные концентрации Ca2+ в диапазоне от 10 мкМ до 5 мМ.

Мы снова использовали сигмоидальную функцию, чтобы подобрать эти данные, получив полумаксимальную эффективную концентрацию Ca2+ (EC50) 420 ± 40 мкМ. Вместе эти данные демонстрируют, что внеклеточный Ca2+ спасает BAPTA от нарушения раннего эмбрионального развития. Со всеми нашими данными EGTA, собранными до сих пор, мы были уверены, что хелаторы Ca2+ действительно нарушают эмбриональное развитие в

X. laevis .

Затем мы обратили внимание на то, когда на раннем этапе эмбрионального развития может потребоваться внеклеточный Ca2+ . Многие важные физиологические события происходят в течение 90 минут, которые проходят между аппликацией спермы и появлением борозд декольте. Уточнение временных рамок покажет, когда может потребоваться внеклеточный Ca2+. Чтобы определить , когда для эмбрионального развития требуется Ca2+, мы провели анализов переноса . Для этих экспериментов яйца осеменяли с 3 мМ BAPTA или без него. После совместной инкубации гамет в течение 30 минут осемененные яйца дважды промывали и переносили в другой раствор: с 3 мМ BAPTA или без него:

Мы обнаружили, что ни у одного из яиц, осемененных в 3 мМ BAPTA, не образовались борозды дробления, независимо от того, были ли они перенесены в раствор с BAPTA или без него.

Эти результаты свидетельствуют о том, что BAPTA нарушает события, происходящие в течение первых 30 минут осеменения.

Яйца, осемененные в присутствии 3 мМ BAPTA или выше, не образовывали борозды дробления во всех исследованных экспериментальных условиях. Однако эти анализы не различают ингибирование событий, происходящих до или сразу после оплодотворения.

Экспериментальные данные, которые мы собрали до сих пор, показали, что внеклеточный Ca2+ необходим незадолго до оплодотворения. Ни один из проведенных до сих пор анализов не различал ингибирование событий, происходящих до или сразу после оплодотворения. Считается, что одним событием оплодотворения, требующим внеклеточного Ca2+, является акросомная реакция, и 50 мМ EGTA блокирует индукцию in vitro в сперматозоидах X. laevis . В акросомной реакции сперматозоиды выделяют во внеклеточное пространство ферменты, которые облегчают проникновение в матрикс, окружающий яйцеклетку. В

X. laevis эта матрица называется желточной оболочкой. Мы пришли к выводу, что если BAPTA предотвращает акросомную реакцию сперматозоидов, то сперматозоиды будут проникать только в желточную оболочку яйцеклеток, осемененных без хелатора Ca2+. Чтобы проверить это экспериментально, мы пометили сперматозоиды Hoescht и, используя флуоресцентную визуализацию, проверили их присутствие в перивителлиновом пространстве.

Мы обнаружили несколько сперматозоидов в перивителлиновом пространстве яиц, осемененных без BAPTA, но не обнаружили сперматозоидов в перивителлиновом пространстве яиц, осемененных BAPTA. Эти данные демонстрируют, что сперматозоиды не проникают через желточную оболочку в присутствии BAPTA, и согласуются с гипотезой о том, что BAPTA предотвращает оплодотворение, предотвращая акросомную реакцию сперматозоидов.

В этот момент мы задались вопросом, как Wilkinson et al. задокументировано эмбриональное развитие яиц, осемененных в присутствии BAPTA. Возвращаясь к рукописи 1998 года, авторы указали, что яйцеклетки были осеменены в 5 мМ BAPTA, а через 5 минут после добавления спермы яйцеклетки были перенесены в раствор, содержащий Са2+. Мы предположили, что сперматозоиды могут проникать в желейный слой, окружающий яйцеклетку, в присутствии BAPTA, но ждать реакции акросом до тех пор, пока не восстановится внеклеточный Ca2+. Только сперматозоиды внутри студенистой оболочки будут перенесены в новый раствор. Мы проверили эту гипотезу путем осеменения яиц в различных условиях, промывания эмбрионов и последующего переноса яиц в новые условия через 5 минут после добавления спермы. Мы обнаружили, что у эмбрионов, осемененных в BAPTA, но перенесенных в раствор, содержащий Са2+, действительно образовались борозды дробления. Дальнейшее подтверждение нашей гипотезы о том, что сперматозоиды проникают в желейный BAPTA, но не оплодотворяются, мы обнаружили, что первые борозды дробления появились примерно на 10 минут позже для этих эмбрионов по сравнению с эмбрионами, осемененными и перенесенными в контрольные растворы.

На тот момент еще не было ясно, как растворы без добавления Ca2+ (и должны иметь низкие концентрации Ca2+, порядка десятков нМ) могут поддерживать оплодотворение и раннее эмбриональное развитие при миллимолярных концентрациях хелаторов Ca2+. требуется для вмешательства в эмбриональное развитие. Мы обратились к желейному слою, окружающему яйцо, и задались вопросом, может ли он служить буфером для свободно доступного Ca2+, поддерживающего оплодотворение. Затем мы оценили содержание диффундирующего Са2+ в желе с помощью фотометрии фура-2. Для этих экспериментов мы инкубировали

яиц X. laevis в растворах без добавления Са2+, собрали эти растворы и измерили Са2+, который диффундировал из слоя желе в окружающие растворы. В четырех испытаниях в среднем 17,5 ± 4,7 нмоль Ca2+ диффундировало из каждого заливного яйца в окружающую среду. Мы обнаружили, что средний диаметр заливных яиц составляет 2,0 ± 0,2 мм, а одного яйца — 1,4 ± 0,02 мм. Основываясь на этих измерениях и предположении, что яйцо и окружающая его желейная оболочка имеют сферическую форму, мы оцениваем, что средний объем желе составляет 2,8 мкл (N = 11 заливных яиц от 4 лягушек). Соответственно, мы оцениваем, что средняя концентрация свободно диффундирующего Ca2+ в гелеобразной оболочке составляет 6,3 ± 1,7 мМ.

Таким образом, мы обнаружили, что внеклеточный Ca2+ необходим для оплодотворения

X. laevis и что слой желе, окружающий яйцо, обогащен свободно диффундирующими ионами Ca2+. Наши данные предполагают, что BAPTA и EGTA мешают развитию борозд дробления, предотвращая акросомную реакцию сперматозоидов, и предполагают, что желейный слой обогащен Ca2+ для поддержки оплодотворения в изменяющихся условиях окружающей среды.

Эта работа была выполнена всеми в лаборатории Карлсона на момент публикации!

Фолликулы какого размера овулируют кобылы?

НексДжен Фармасьютикалз 22 января 2020 г.

Фолликул яичника представляет собой наполненный жидкостью мешок, окруженный группой клеток, защищать и питать яйцеклетку (яйцо). В одном фолликуле тысячи фолликулов. яичников кобылы, но обычно во время каждой течки начинает развиваться только один цикл. ¹ К 16 дню цикла кобылы развивающийся фолликул достиг размера, при котором он выделяет достаточно гормона, чтобы вызвать внешнее характеристики тепла.

Как формируется доминантный фолликул, он продуцирует ингибин и подавляет рост другие фолликулы в яичниках. Именно в этот момент мы видим «звездную вспышку». на поперечном срезе матки. (Рисунок выше, справа). Хотя звездообразование есть часто ассоциируется с первой овуляцией сезона, это не безошибочный показатель того, что вот-вот произойдет первая овуляция. ²

Критерии и Неразрывность

В кобыл фолликулы обычно овулируют при диаметре от 35 до 55 мм. Это важно, однако, установить исходные данные для текущих измерений кобыл фолликулов в рамках программы разведения, а также преемственность в определении сопутствующие измерения. В доступной литературе предлагаются такие критерии, как следующие для полноразмерных лошадей и пони:

• Фолликулярная диаметр должен быть определен путем усреднения самых широких и самых узких видимых частей на УЗИ. Вероятны различия между ними, что означает, что пальпация может привести к менее точным оценкам диаметра
• Большинство кобыл меньше вероятность овуляции с фолликулом меньше 35 мм
• Двойной овуляции с фолликулами в одном и том же яичнике, скорее всего, произойдут с меньшими диаметр фолликулов — возможно менее 35 мм
• Фолликулярная рост примерно 3-5 (три-пять) мм в сутки
• Маточная отек — важный показатель эструса — достигает пика примерно за 36 часов до овуляции у здоровых кобыл. Кобылы, у которых отек сохраняется ближе к или после овуляции чаще имеют проблемы с задержкой очищения матки
• Изменение правильность формы фолликулов, видимая на УЗИ — с тенденцией к форма «слеза» или «гитарный медиатор» — скорее всего, будет замечена в течение 24 часов до овуляции примерно в 85% преовуляторных фолликулов
• А утолщение стенки фолликула, видимая на УЗИ, о чем свидетельствует более толстый белый линия, окружающая фолликул (особенно заметна по нижнему краю) — это может наблюдаться в течение 24 часов до овуляции примерно у 85% женщин. преовуляторные фолликулы
• яичников чувствительность к прикосновению при пальпации per rectum может быть продемонстрирована в пределах За 12 часов до овуляции у некоторых кобыл (убедитесь, что вы различаете это от кобылы, которая всегда чувствительна при пальпации. яичников маркер «чувствительность» относится только к кобылам, у которых наблюдается изменение реакции)
• Большинство фолликулы станут мягче при пальпации в прямой кишке в течение 6-12 часов до к овуляции. Хотя легче определить при пальпации, применение легкого давление ректальным датчиком УЗИ, что приводит к уплощению верхняя поверхность изображения фолликула также может свидетельствовать о фолликулярном размягчение
• Большинство фолликулы немного уменьшатся в среднем диаметре в какой-то момент в течение 6 часов до овуляции
• Может быть незначительные признаки белых пятнышек в фолликулярной жидкости в течение 12 часов до овуляции, что не следует путать с признаками ановуляторной геморрагический фолликул
• Видимое «вытекание» фолликулярной жидкости за пределы основная часть фолликула на УЗИ свидетельствует о немедленном приближающаяся или текущая овуляция ²

Размер и Созревание

В примерно на 20-й день фолликул достигает своего полного размера от 35 мм до 55 мм и разрывается, высвобождая яйцеклетку в маточную трубу (овуляция). лопнувший фолликул образует желтое тело, выделяющее гормоны, подготовить матку к беременности. После овуляции яйцеклетка остается в фаллопиевы трубы, где она выживает до 12 часов и должна быть оплодотворена спермы в течение этого времени, если беременность должна быть достигнута. ¹

В идеале кобылу разводят за несколько часов до овуляции, чтобы сперма уже была в маточной трубе при выходе яйцеклетки. Точно зная, когда кобыла готова к овуляции, необходима для эффективной программы разведения: 50% кобыл овуляция за 24 часа до окончания течки, при этом 30% овуляции за 48 часов до конец тепла. Некоторые кобылы могут иметь течку, но не овулировать, в то время как другие овуляция без явных признаков течки.

Прочие факторы

А 65% зачатия (беременности) считается средним показателем для коневодства. ферма. К сожалению, это означает, что 35% всех разводимых кобыл остаются открытыми. до следующего сезона размножения. ³ Другие факторы, которые могут повлиять развитие фолликулов и фертильность в целом включают возраст (ожидается снижение фертильности, начиная с 12-летнего возраста), окружающая среда и диета.

Для кобыл, ректальная пальпация ветеринаром дает важную информацию относительно состояния половых путей, и может подтвердить наличие фолликула. Дальнейшее обследование, включая УЗИ матки, биопсию матки, и культуры могут быть рекомендованы. Наконец, конформация вульвы должна периодически обследовать, чтобы определить, восприимчива ли кобыла к маточному инфекции, которые становятся более вероятными с возрастом кобылы.

Товары для разведения лошадей

Товары для разведения лошадей вы найдете в нашем интернет-магазине. Войдите в свою учетную запись, чтобы просмотреть цены и совершить покупку или создать учетную запись. Обратите внимание, что для создания учетной записи у вас должна быть действующая ветеринарная лицензия. Если вы этого не сделаете, пожалуйста, передайте нашу информацию своему ветеринару.

¹ Хантингтон, П., ДВМ. Развитие фолликулов и овуляция у кобыл, equinews.com, 2014.
² equine-reproduction.